劉光霞 趙連春 陳芳 牛麗霞 盧亞敏 高偉 侯瞻

(1.河北省人民醫(yī)院核醫(yī)學科，河北 石家莊 050051；2.河北以嶺醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050091;3.河北省人民醫(yī)院檢驗科， 河北 石家莊 050051)

甲狀腺濾泡癌嚴重危害人們健康，病變的形成、進展與多種遺傳物質(zhì)及細胞因子的改變有關(guān)[1]。微小RNA(miRNA)是近年關(guān)注到的與腫瘤形成有關(guān)的基因，是由19-25個核苷酸組成的非編碼單鏈小RNA，通過與目標基因非翻譯區(qū)結(jié)合，調(diào)控細胞的異型增殖[2-3]。本研究應(yīng)用TCGA、NCBI GEO Data Sets數(shù)據(jù)庫進行交叉篩選，選取與甲狀腺濾泡癌密切相關(guān)、文獻報道鮮少的微小RNA-215-5p(miR-215-5p)進行研究，分析其在腫瘤中的表達特征，并探討miR-215-5p與促甲狀腺激素(TSH)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般材料 選取2014年3月～2017年4月河北省人民醫(yī)院和河北以嶺醫(yī)院確診為甲狀腺濾泡癌行手術(shù)治療的55例患者術(shù)后組織為觀察組。納入標準：①均為明確診斷的甲狀腺濾泡癌，并由病理醫(yī)師復核切片。②首次確診。③臨床及病理資料齊全。排除標準：①診斷有異議者。②術(shù)前行放、化療者。③隨訪資料不全或家屬不同意觀察者。留取術(shù)前血清標本及術(shù)后組織標本。另選取55例經(jīng)病理確診為甲狀腺濾泡性腺瘤為對照組。留取術(shù)后組織標本。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核并批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 miR-215-5p檢測 應(yīng)用實時熒光定量PCR法檢測兩組中miR-215-5p的表達。采用TRIZOL試劑(美國，Invitrogen公司)提取細胞總RNA后，通過逆轉(zhuǎn)錄實驗合成cDNA(日本，TaKaRa公司)，按照相應(yīng)qPCR試劑盒說明書檢測miR-215-5p水平。引物由上海碧云天公司合成，miR-215-5p上游引物：5′-GTCAACCATCGCTGCATCCAC-3′；下游引物：5′-GACTGACGACGTCCGTGCCAC3′。以U6為內(nèi)參，引物上游：5′-GGAAGTAGCACCTGATTAGC-3′下游：5′-TTGGAATACGAATTCCG-3′。擴增反應(yīng)條件：95 ℃ 8 min。95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，31個循環(huán)。將miR-215-5p的表達針對U6標準化，采用2-△△Ct表示相對水平進行分析。

1.2.2 免疫組化法檢測Ki67的表達 應(yīng)用免疫組化SP法檢測甲狀腺濾泡癌組織中Ki67的表達。Ki67濃縮液和DAB均購自武漢博士德生物技術(shù)公司?；谑灠窠M織進行檢測，切取4 μm切片。先按不同比例進行預(yù)實驗，選擇預(yù)實驗中顯色最理想的濃度(Ki67為1∶200)用于正式實驗。正式實驗均由同一技師操作，DAB顯色。陽性部位是細胞核，選擇5個400倍視野(熱點區(qū))進行觀察，計算陽性率的平均值。Ki67的陽性率亦稱為增殖指數(shù)。

1.2.3 電化學發(fā)光法檢測血清中TSH的表達 抽取術(shù)前患者的空腹靜脈血，4000轉(zhuǎn)/min離心15 min后，應(yīng)用電化學發(fā)光法檢測血清中TSH的表達。做好質(zhì)控工作，減少人為誤差。

2 結(jié)果

2.1 患者的一般資料 甲狀腺濾泡癌患者共55例，其中男性29例，女性26例；年齡32～78歲，中位年齡57歲；腫瘤最大徑1～7.8 cm，平均(4.2±1.2)cm; TNM分期Ⅰ期32例，Ⅱ期13例，Ⅲ期8例，Ⅳ型2例。對照組共55例，其中男性28例，女性27例；年齡28～75歲，中位年齡56歲。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。病理形態(tài)見圖1。

圖1 病理形態(tài)圖(200×)

2.2 兩組miR-215-5p 表達的比較 觀察組miR-215-5p的表達量(1.36±0.09)明顯低于對照組(2.29±0.18)，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.57，P=0.002)，見圖2。

2.3 miR-215-5p在不同臨床病理特征分組中表達的比較 miR-215-5p 的表達在不同腫瘤最大徑、Ki67增殖指數(shù)和TNM分期的分組中差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。而在不同性別、年齡的分組中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1、圖3。

圖2 miR-215-5p在兩組中表達的比較

表1 miR-215-5p在不同臨床病理特征分組中表達的比較

圖3 Ki67的表達(200×)

2.4 miR-215-5p 表達的生存分析 患者均進行術(shù)后3年的隨訪，截止時間點為2020年1月31日。其中，存活39例，死亡9例，失訪7例。死亡患者確診后的生存時間為6～36個月，中位生存期為21個月。以miR-215-5p表達的平均值(1.36)為臨界值行K-M生存分析，顯示miR-215-5p的表達與預(yù)后相關(guān)(2=5.46，P=0.028)，即miR-215-5p低表達患者的預(yù)后差，見圖4。

圖4 miR-215-5p 表達的生存分析

2.5 觀察組miR-215-5p與血清TSH的相關(guān)性 電化學發(fā)光法檢測到血清中TSH的表達范圍為0.27～4.20 μIU/mL，平均為(3.12±1.16)μIU/mL。相關(guān)分析顯示，血清中miR-215-5p 與TSH呈負相關(guān)(r=-0.61，P=0.012)，見圖5。

圖5 miR-215-5p與TSH的相關(guān)性

3 討論

甲狀腺濾泡癌發(fā)生機制涉及多種分子生物學通路，與DNA、RNA及蛋白的表達失調(diào)均有關(guān)[4]。近年學者認為，P53和細胞增殖是甲狀腺濾泡癌病變形成的經(jīng)典途徑[5]，并發(fā)現(xiàn)其影響因素較多。近年學者關(guān)注到miRNAs異常表達對腫瘤的進展有促進作用[6-7]，并發(fā)現(xiàn)了多種對甲狀腺異常增殖細胞中有影響的P53和增殖調(diào)控的miRNAs[8]。因此，本研究在實驗前進行篩查，選擇miR-215-5p進行實驗研究，同時也發(fā)現(xiàn)miR-215-5p異常表達對腫瘤細胞增殖和凋亡有一定的調(diào)節(jié)作用[9-10]。有資料顯示，miR-215-5p在人體正常的組織和細胞中具有一定的表達量，而在腫瘤性病變中常伴有miR-215-5p表達的下調(diào)[11]。miR-215-5p可能作為腫瘤抑制基因發(fā)揮作用。miR-215-5p下游基因較多，包括增殖相關(guān)基因、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等[12-13]。

本研究結(jié)果顯示，甲狀腺濾泡癌中miR-215-5p低表達，提示miR-215-5p低表達對腫瘤的形成有促進作用。miR-215-5p具有抑癌基因樣的作用，通過與下游靶基因的3′UTR結(jié)合調(diào)控mRNA實現(xiàn)其功能[14-15]。本研究結(jié)果亦顯示，miR-215-5p 的表達在不同腫瘤最大徑、Ki67增殖指數(shù)的分組中差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示miR-215-5p低表達預(yù)示腫瘤處于較高的增殖狀態(tài)，腫瘤生長快，對周圍的侵襲性強[16]。從細胞動力學角度分析，正常甲狀腺上皮細胞屬于穩(wěn)定狀態(tài)的細胞群，其細胞增殖和死亡的速度均較低，在腫瘤性因素的刺激下發(fā)生明顯增殖，miR-215-5p的異常表達使增殖平衡打亂，正調(diào)節(jié)和負調(diào)節(jié)失平衡，細胞增殖旺盛。miR-215-5p是細胞分化等多種生理過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，miR-215-5p介導的復雜而精確的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機制在維持細胞增殖的動態(tài)平衡中具有關(guān)鍵作用。有研究顯示，miR-215-5p異常表達可以調(diào)控CTCF的翻譯來降低GATA4、NKX2.5和WNT的表達量[8]，這表明miR-215-5p的調(diào)控是多元性的，其調(diào)控機制復雜。生存分析發(fā)現(xiàn)，miR-215-5p的表達與預(yù)后有關(guān)，提示miR-215-5p可能對判斷預(yù)后有一定價值，即miR-215-5p低表達的患者生存時間短，預(yù)后差。這與miR-215-5p在不同TNM分期的表達中差異有統(tǒng)計學意義的結(jié)論一致。但是miR-215-5p對預(yù)后判斷的應(yīng)用尚需要后續(xù)進行多中心、大樣本及多因素分析后進一步明確。本研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺濾泡癌組織中miR-215-5p 與血清TSH呈負相關(guān)，提示兩者可能具有協(xié)同作用，但機制不清楚。由于TSH由垂體分泌，可能與miR-215-5p作為調(diào)節(jié)內(nèi)分泌細胞的因子有關(guān)[17-18]。也有學者在垂體瘤中發(fā)現(xiàn)多種miRNAs表達[19]，這可能是兩者具有關(guān)系的機理之一，兩者的關(guān)聯(lián)性為后續(xù)研究miR-215-5p提供了創(chuàng)傷性小及取材容易的方法。

4 結(jié)論

miR-215-5p在甲狀腺濾泡癌中的表達下降，其與病變的臨床特征相關(guān)，且與TSH呈負相關(guān)。miR-215-5p 的表達可能與預(yù)后有關(guān)。