李楠，何于雯，孟錦昕，王靜林

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南 昆明 650224)

Negevirus病毒，為單股正鏈RNA病毒，是新發(fā)現(xiàn)的昆蟲特異性病毒，這類病毒可分為Nelorpivirus和Sandewavirus[1,2]兩個不同的進(jìn)化分支。Nelorpivirus進(jìn)化分支由Negev virus(NEGV)、Loreto virus(LORV)和 Piura virus(PIUV)組成；Sandewavirus進(jìn)化分支包括Santana virus(SANV)、Dezidougou virus(DEZV)、Wallerfield virus(WALV)以及相關(guān)病毒[3,4]。2014年，從菲律賓采集的蚊蟲分離到4株病毒，經(jīng)鑒定為Sandewavirus進(jìn)化分支的一個新種病毒，Tanay病毒[5]。2013年，從廣西采集的庫蚊標(biāo)本中再次分離獲得7株Tanay-like病毒，但與菲律賓的Tanay病毒全基因組核苷酸序列存在20%左右的差異[6]，提示廣西分離的病毒可能是新的Tanay病毒。本研究通過透射電子顯微技術(shù)對Tanay病毒粒子的形態(tài)進(jìn)行觀察，以期為該病毒的基礎(chǔ)理論研究及人或動物相關(guān)蟲媒病毒病的防控研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

病毒株及細(xì)胞：GX13M50株病毒于2013年分離自廣西南寧市馬山縣郊區(qū)采集的致倦庫蚊(Culexquinquefasciatus)，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為Tanay病毒，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；C6/36細(xì)胞由云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室提供。

1.2 病毒復(fù)壯及培養(yǎng)

將培養(yǎng)長至單層的25 cm2大小的C6/36細(xì)胞倒去培養(yǎng)液，接種200 μL解凍后的GX13M50病毒液，置于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)吸附1 h，棄去病毒液，加入含2%胎牛血清的細(xì)胞維持液，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，將培養(yǎng)2代的細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次后作為復(fù)壯后的種子病毒，取復(fù)壯后的GX13M50病毒液接種C6/36細(xì)胞，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)并每日觀察細(xì)胞病變情況。

1.3 電鏡觀察

當(dāng)細(xì)胞剛出現(xiàn)病變未脫落時，留約1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，用細(xì)胞刮將細(xì)胞輕輕刮下，1 000 r/min離心20 min,棄上清，沉淀用2.5%戊二醛置于4 ℃固定2 h，再用1%鋨酸固定2 h，乙醇梯度脫水后，沉淀用環(huán)氧樹脂浸漬、包埋，用超薄切片機(jī)將細(xì)胞沉淀物切成80 nm厚的超薄切片，用1%醋酸雙氧鈾和0.2%檸檬酸鉛雙重染色后用電鏡觀察病毒粒子。

2 結(jié)果

2.1 GX13M50感染C6/36細(xì)胞的病變觀察

用復(fù)壯后的GX13M50病毒液接種C6/36細(xì)胞，接種96 h后開始產(chǎn)生細(xì)胞病變，其特征為細(xì)胞聚集、折光性變強(qiáng)、脫落(圖1)。

A B

2.2 病毒粒子電鏡觀察

通過電鏡觀察可以清晰地看到，C6/36 細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中存在較多的子代病毒聚集，并可見成熟病毒粒子釋放出胞；成熟Tanay病毒粒子呈橢圓形，直徑大約為50 nm，并有一個短的突出物(圖2)。

A B

3 討論

Negevirus病毒大多分離自蚊蟲、白蛉等吸血昆蟲，尤其在蚊蟲中有較高的感染率。蚊蟲是很多致病病毒的載體，其中許多對人類及動物的健康都有相當(dāng)大的影響，如登革熱病毒、基孔肯雅病毒和日本腦炎病毒等均可致人類嚴(yán)重疾病[7,8]。Negevirus病毒可以在蚊子細(xì)胞中復(fù)制，但不能在脊椎動物細(xì)胞中復(fù)制，通常不會引起宿主動物疾病[9]。有研究報道，許多經(jīng)節(jié)肢動物傳播的感染脊椎動物和植物的病毒最初是節(jié)肢動物病毒[10]。感染的蚊蟲在吸血過程中，使病毒與脊椎動物親密接觸，從而可能增加病毒適應(yīng)脊椎動物的能力并成為其病原體。此外，這些新分離的病毒地理分布和昆蟲宿主范圍廣泛，推測很有可能會感染其他類型的昆蟲；這些病毒在昆蟲宿主中傳播及其在自然界的循環(huán)還有待進(jìn)一步研究。Negevirus病毒的進(jìn)一步分離及鑒定，對了解這類病毒的地理分布、遺傳進(jìn)化以及蚊媒疾病的控制具有重要意義。

本研究通過C6/36細(xì)胞對廣西新分離病毒GX13M50株進(jìn)行復(fù)壯及培養(yǎng)，接種96 h后，被感染細(xì)胞出現(xiàn)聚集、折光性變強(qiáng)、脫落等明顯病變特征；進(jìn)一步的超薄切片電鏡觀察結(jié)果顯示，Tanay病毒寄生在C6/36 細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，利用細(xì)胞質(zhì)的養(yǎng)分進(jìn)行增殖；說明該病毒對C6/36細(xì)胞有較好的適應(yīng)性。2013年Vasilakis等最早通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)Negev、Ngewotan、Piura、Loreto、Dezidougou和 Santana病毒粒子呈球形顆粒，直徑為45～55 nm[11]。本研究中對Tanay病毒形態(tài)觀察結(jié)果顯示，病毒粒子為橢圓形，直徑約50 nm，并具有一個短的突起；該病毒粒子具有明顯的形態(tài)學(xué)特點，這與Nabeshima[5]等報道的Tanay病毒負(fù)染電鏡觀察結(jié)果一致。電鏡觀察是最常用的病原鑒定方法，可快速診斷及鑒別病毒感染，本研究有助于了解Tanay病毒的形態(tài)學(xué)特征，為該病毒的形態(tài)學(xué)診斷及進(jìn)一步深入研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

致謝：感謝公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303035)在昆蟲樣品采集中給予的資助，感謝廣西獸醫(yī)研究所吳健敏教授在標(biāo)本采集給予支持和幫助，感謝曹穎穎在病毒分離中給予的幫助。