左玲莉 周麗婷 吳興旗 吳超逸 吳淑燕

（1. 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，蘇州 215123；2. 蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，蘇州 215129）

沙門菌（Salmonella）是一類經(jīng)糞口途徑傳播的革蘭陰性菌，人和禽畜均可感染。2019 年加拿大六省沙門菌感染大暴發(fā)引起世界范圍內(nèi)的關(guān)注［1］。根據(jù)宿主感染后的臨床表現(xiàn)，沙門菌可分為傷寒沙門菌（typhoidalSalmonella，TS）和非傷寒沙門菌（non-typhoidalSalmonella，NTS）兩大類，前者主要包括傷寒和副傷寒沙門菌。除上述沙門菌以外的血清學(xué)歸為NTS，在NTS 各血清型導(dǎo)致的全身感染中，鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium，S. typhimurium）是最常見(jiàn)的致病菌之一，約占65.2%［2］。免疫功能正常者感染鼠傷寒沙門菌多表現(xiàn)為胃腸炎型，免疫功能不全者則以敗血癥型和混合型多見(jiàn)［3］。我國(guó)感染性腹瀉病因中鼠傷寒沙門菌感染占23.53%［4］。與此同時(shí)，鼠傷寒沙門菌血清型的不斷變異和耐藥菌株的相繼出現(xiàn)為臨床治療增加了困難［5］。鼠傷寒沙門菌作為研究細(xì)菌致病機(jī)制與宿主相互作用的工具菌，已建立成熟的體內(nèi)外模型［6］。因此，將其作為模式菌株，深入研究其致病機(jī)制并制定防控新策略具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

鼠傷寒沙門菌在與宿主的抗衡過(guò)程中，進(jìn)化出一套精密的調(diào)控系統(tǒng)逃避宿主的免疫殺傷，其通過(guò)毒力島2（Salmonellapathogenicity island 2，SPI-2）依賴的Ⅲ型分泌系統(tǒng)（type Ⅲ secretion system，T3SS）分泌的效應(yīng)蛋白形成沙門菌包裹囊泡（Salmonella-containing vacuole，SCV），為自身復(fù)制和繁殖提供有利場(chǎng)所［7］。鼠傷寒沙門菌常含約8 kb的沙門菌質(zhì)粒毒力基因（Salmonellaplasmid virulence gene，spv），該基因與細(xì)菌的毒力表型密切相關(guān)。spv基因由spvR、spvA、spvB、spvC和spvD五個(gè)開(kāi)放閱讀框組成［8］。其中spvB和spvC是研究最為廣泛的兩個(gè)毒力基因，與鼠傷寒沙門菌感染所致疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。spvB編碼的效應(yīng)蛋白SpvB 羧基末端結(jié)構(gòu)域具有ADP 核糖基轉(zhuǎn)移酶活性［9］，能阻止肌動(dòng)蛋白單體聚合，引起細(xì)胞骨架解聚［10-11］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證明在鼠傷寒沙門菌感染進(jìn)程中spvB可抑制宿主細(xì)胞自噬，加重?fù)p傷［12］。spvC編碼產(chǎn)物SpvC 具有磷酸蘇氨酸裂解酶活性，可特異性地使絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)傳導(dǎo)通路不可逆的去磷酸化失活［13］。文獻(xiàn)表明spvC可通過(guò)ERK 1/2 途徑抑制腸道早期炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)菌全身播散［14］。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)spvC影響焦亡與其抑制腸道炎癥促進(jìn)細(xì)菌播散密切相關(guān)，但spvB與spvC的互作及其深入的致病機(jī)制尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。

λRed 同源重組系統(tǒng)是一種基于同源重組原理，對(duì)細(xì)菌染色體DNA 直接修飾的基因編輯系統(tǒng)，可在原核生物中實(shí)現(xiàn)快速的基因敲除。該系統(tǒng)需要pKD46、pKD4 和pCP20 三種質(zhì)粒。pKD46 是λRed同源重組系統(tǒng)的協(xié)助質(zhì)粒，L-阿拉伯糖誘導(dǎo)后可表達(dá)exo、bet和gam3 個(gè)基因編碼的λ 噬菌體重組酶［15］。Exo 與Bet 引導(dǎo)線性片段與待敲除區(qū)域重組置換，Gam 抑制RecBCD 核酸外切酶的活性，使外源線性DNA 不至立即被降解［16］。pKD46 是溫度敏感復(fù)制子，30℃培養(yǎng)可表達(dá)重組酶，37℃培養(yǎng)質(zhì)粒則丟失。pKD4 為同源打靶片段提供卡那霉素（Kan）抗性基因的模板，兩側(cè)含翻轉(zhuǎn)酶結(jié)合位點(diǎn)（Flipase recognition target，F(xiàn)RT），為重組轉(zhuǎn)化體提供篩選標(biāo)志。pCP20 編輯的翻轉(zhuǎn)酶重組酶（Flipase recombination enzyme，F(xiàn)LP）可識(shí)別FRT 位點(diǎn)使之發(fā)生自身同源重組，從而消除一個(gè)FRT 位點(diǎn)及抗性基因［17］。pCP20 在42℃時(shí)誘導(dǎo)重組酶表達(dá)，同時(shí)質(zhì)粒逐漸丟失。λRed 同源重組系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)便，同源重組效率高，且對(duì)菌株生長(zhǎng)整體無(wú)影響等優(yōu)點(diǎn)［18-19］。

pBAD/g Ⅲ表達(dá)系統(tǒng)由araBDA 啟動(dòng)子啟動(dòng)，帶有g(shù) Ⅲ分泌信號(hào)和氨芐青霉素（Amp）抗性基因，L-阿拉伯糖能調(diào)控和誘導(dǎo)其表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物羧基末端含有His 尾。這一標(biāo)簽不影響目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，有利于蛋白的鑒定和篩選［20］。一般條件下，重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性受細(xì)菌代數(shù)影響，研究表明利用pBAD/g Ⅲ原核表達(dá)載體構(gòu)建的重組菌連續(xù)傳代30代后，質(zhì)粒目的基因片段仍具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性［21］。

鑒于此， 本研究利用λRed 重組系統(tǒng)和pBAD/g Ⅲ原核表達(dá)載體對(duì)spvBC進(jìn)行基因編輯，構(gòu)建鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvBC敲除株和回補(bǔ)株，為深入探究鼠傷寒沙門菌致病機(jī)制及宿主的免疫應(yīng)答提供可利用的工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 質(zhì)粒pKD46、pKD4 和pCP20由普渡大學(xué)周道國(guó)教授惠贈(zèng)。pBAD/g Ⅲ由江蘇大學(xué)黃新祥教授惠贈(zèng)。鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株野生型SL1344 由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)楊倩教授惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑和儀器 T4 DNA Ligase、XhoI 及EcoR I 限制性內(nèi)切酶購(gòu)自日本TaKaRa 公司；Easy Taq DNA Polymersae 購(gòu)自中國(guó)全式金生物技術(shù)有限公司；Kod-Plus-Neo 高保真PCR 酶購(gòu)自日本ToYoBo公司；鼠抗His 抗體購(gòu)自優(yōu)寧維生物技術(shù)有限公司；鼠二抗購(gòu)自R&D Systems 公司；質(zhì)粒小提試劑盒、通用型DNA 純化回收試劑盒購(gòu)自中國(guó)天根生化科技有限公司。PCR 擴(kuò)增儀購(gòu)自中國(guó)杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；核酸電泳電泳系統(tǒng)購(gòu)自中國(guó)上海天能科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)SYNGENE 公司；電轉(zhuǎn)化儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 利用GenBank 公布的鼠傷寒沙門菌spvB（ID：13909717） 及spvC（ID：13909727）基因序列，設(shè)計(jì)敲除引物H1P1和H2P2。5'端分別為50 ntspvB基因上游和spvC基因下游同源序列，3'端為pKD4kan抗性基因（兩側(cè)含F(xiàn)RT 位點(diǎn)）的上下游引物序列。此外，在spvBC基因的外側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)鑒定引物P3和P4。該引物擴(kuò)增產(chǎn)物中spvBC被kan替換后為1 747 bp，kan抗性基因消除后的敲除株中為356 bp。根據(jù)spvBC基因序列設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增引物spvBC-F（XhoI）和spvBC-R（EcoR I），并在引物5'端特異性酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。引物序列見(jiàn)表1。

1.2.2 同源打靶片段的擴(kuò)增 以pKD4 為模板，利用引物H1P1和H2P2PCR 擴(kuò)增含spvBC同源臂及FRT 位點(diǎn)的kan抗性基因片段，PCR 反應(yīng)體系：DNA 模板5 μL，引物H1P1和H2P2（10 μmol/L）各1.5 μL，Kod-Plus-Neo 高保真PCR 酶1 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs 5 μL，Mg2+1 μL 去離子水30 μL。PCR 反應(yīng)步驟：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，68℃ 90 s，循環(huán)30 次；68℃ 7 min。利用DNA 純化回收試劑盒純化回收DNA 片段。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列

1.2.3 感受態(tài)的制備及Red 重組酶的誘導(dǎo)表達(dá) 鼠傷寒沙門菌SL1344 37℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。按1∶50 轉(zhuǎn)接菌液于100 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)至OD600約0.6。將菌液冰浴20 min，在4℃條件下4 000 r/min 離心15 min，棄上清。加入冰浴的滅菌單蒸水10 mL 重懸，4 000 r/min 離心15 min，棄上清，重復(fù)洗滌3 次。再用冰浴的10%甘油10 mL 重懸，4 000 r/min 離心15 min，棄上清，洗滌1 次。最后加入冰浴的10%甘油500 μL 重懸，分裝后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將感受態(tài)細(xì)胞冰上解凍，無(wú)菌電轉(zhuǎn)杯冰上預(yù)冷。質(zhì)粒pKD46 與感受態(tài)按1∶50 比例冰上混勻后進(jìn)行電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)條件：電壓2.5 KV，電容25 μF，電阻300 Ω，電轉(zhuǎn)杯厚度2 mm。電轉(zhuǎn)后立即加入預(yù)熱到30℃的SOC 培養(yǎng)基混勻，30℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)3 h。離心去上清，收集菌體，均勻涂布于含100 μg/mL Amp 的瓊脂平板上，30℃培養(yǎng)過(guò)夜篩選陽(yáng)性菌落。取新鮮單菌落接種于含3 mL 100 μg/mL Amp的LB 液體培養(yǎng)基，在終止培養(yǎng)前1 h 加入L-阿拉伯糖（終濃度30 mmol/L）誘導(dǎo)重組酶表達(dá)，再按照上述方式制備成含質(zhì)粒pKD46 的感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.4 同源打靶片段的電擊轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆的篩選 取1 μL 純化后的同源打靶片段電轉(zhuǎn)入含質(zhì)粒pKD46 的感受態(tài)細(xì)胞中，電轉(zhuǎn)條件同1.2.3。電轉(zhuǎn)后立即加入預(yù)熱的SOC 培養(yǎng)基混勻，30℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)1 h 后37℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h。離心去上清，收集菌體，均勻涂布于含50 μg/mL Kan 的瓊脂平板上，30℃培養(yǎng)過(guò)夜篩選陽(yáng)性菌落。取單菌落利用引物P3、P4進(jìn)行菌落PCR，鑒定完全重組的陽(yáng)性菌落SL1344-ΔspvBC∷kan。

1.2.5 質(zhì)粒pKD46 的消除 將陽(yáng)性菌落涂布于Kan平板純化3 次后于42℃培養(yǎng)過(guò)夜，將獲得的單菌落分別涂布于含Amp 和Kan 的瓊脂平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。在Kan 平板上生長(zhǎng)而在Amp 平板上不生長(zhǎng)的KanRAmpS菌落即為消除pKD46 的陽(yáng)性菌落。

1.2.6 卡那霉素抗性基因的消除 將消除質(zhì)粒pKD46 的陽(yáng)性菌落按方法1.2.3 制成感受態(tài)細(xì)胞備用。將質(zhì)粒pCP20 按1.2.3 方法電轉(zhuǎn)入消除質(zhì)粒pKD46 的感受態(tài)細(xì)胞中。產(chǎn)物涂布于Amp 平板，30℃培養(yǎng)過(guò)夜。將所得陽(yáng)性克隆分別涂布于含Amp或Kan 的瓊脂平板上，30℃過(guò)夜培養(yǎng)。在含Kan 的平板上不生長(zhǎng)而在含Amp 的平板上生長(zhǎng)的AmpRKanS菌落即為消除Kan 抗性的陽(yáng)性菌落SL1344-ΔspvBC∷FRT。

1.2.7 質(zhì)粒pCP20 的消除 將上述單菌落涂普通平板于42℃過(guò)夜培養(yǎng)以消除質(zhì)粒pCP20。所得陽(yáng)性菌落同時(shí)涂普通平板、Amp 平板和Kan 平板，30℃培養(yǎng)過(guò)夜，普通平板生長(zhǎng)而抗性平板不生長(zhǎng)得菌落為成功消除kan片段和質(zhì)粒pCP20 的敲除株。連續(xù)傳代3 次，利用引物P3、P4經(jīng)PCR 鑒定spvBC基因敲除株SL1344-ΔspvBC。

1.2.8spvBC基因的擴(kuò)增 以鼠傷寒沙門菌SL1344全基因組DNA 為模板，利用引物spvBC-F（XhoI）及spvBC-R（EcoR I）PCR 擴(kuò)增含酶切位點(diǎn)的spvBC基因片段。PCR 反應(yīng)體系同1.2.2。PCR 反應(yīng)步驟：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，68℃ 3 min，循環(huán)30 次；68℃ 7 min。利用DNA 純化回收試劑盒純化回收DNA 片段。

1.2.9 pBAD-spvBC重組質(zhì)粒及回補(bǔ)株的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶XhoI 和EcoR I 分別對(duì)上述PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pBAD 雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并切膠回收。將PCR 回收產(chǎn)物與載體質(zhì)粒按體積比3∶1 混勻后經(jīng)T4 DNA Ligase 在4℃連接過(guò)夜，最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆。利用引物spvBC-F（XhoI）和spvBC-R（EcoR I）進(jìn)行菌落PCR 鑒定，根據(jù)鑒定結(jié)果測(cè)序，與GeneBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中spvBC序列進(jìn)行比對(duì)。將pBAD-spvBC重組質(zhì)粒以電轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入鼠傷寒沙門菌spvBC基因敲除株內(nèi)，操作步驟同1.2.3，涂布于Amp 瓊脂平板篩選陽(yáng)性克隆，連續(xù)傳代3 次后所得單菌落即為鼠傷寒沙門菌spvBC基因回補(bǔ)株SL1344-c-spvBC。

1.2.10 Western blot 檢測(cè)spvBC回補(bǔ)株SpvB 及SpvC蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將回補(bǔ)株SL1344-c-spvBC接種到3 mL 含有Amp 的LB 液體培養(yǎng)基中，搖菌過(guò)夜培養(yǎng)，以SL1344-WT 和SL1344-ΔspvBC作為對(duì)照。取50 μL 菌液接種到5 mL 含Amp 的LB 液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，再分別加入1.3 mmol/L 和13 mmol/L L-阿拉伯糖誘導(dǎo)繼續(xù)培養(yǎng)3 h。將菌液4 000 rpm 離心5 min，棄上清，PBS 洗滌3 次。加入10 μL SDSPAGE 上樣緩沖液，混合均勻，將樣品置于100℃加熱5 min，-20℃保存待用。以SpvB 抗體檢測(cè)回補(bǔ)株SL1344-c-spvBC中蛋白SpvB 的表達(dá)，His 標(biāo)簽抗體檢測(cè)回補(bǔ)株SpvC 蛋白（含His 標(biāo)簽）的表達(dá)情況。取30 μg 樣品上樣進(jìn)行SDS-PAGE 電泳（濃縮膠60 V，約40 min；分離膠120 V，約40 min）。將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜上（200 mA 恒流，60 min），置于搖床室溫封閉1 h。用抗體稀釋液稀釋鼠抗SpvB、His抗體（1∶1 000 稀釋），4℃孵育過(guò)夜。TBST 洗滌3次，每次10 min?？贵w稀釋液稀釋山羊抗小鼠IgGHRP（1∶3 000 稀釋），室溫孵育1 h。TBST 洗滌3次，每次10 min?；瘜W(xué)發(fā)光法顯影，檢測(cè)SpvB 及帶His 標(biāo)簽的SpvC 蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 spvBC同源打靶片段的擴(kuò)增

以pKD4 為模板，利用引物H1P1和H2P2PCR擴(kuò)增spvBC同源打靶序列。該引物擴(kuò)增含F(xiàn)RT 位點(diǎn)的kan片段為1 496 bp，加上兩端50 bp 的spvBC同源臂，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)為1 596 bp。瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增產(chǎn)物大小與理論值相符，表明成功擴(kuò)增出含spvBC同源臂和kan抗性的DNA 片段（圖1-A）。

2.2 spvBC同源打靶片段的轉(zhuǎn)化與重組

將純化后含同源臂的kanDNA 片段電轉(zhuǎn)入含質(zhì)粒pKD46 的感受態(tài)細(xì)胞中，涂Kan 平板，30℃培養(yǎng)，篩選出陽(yáng)性菌落。利用引物P3、P4進(jìn)行菌落PCR鑒定，基因spvBC被kan替換后為1 747 bp。瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增產(chǎn)物大小與理論值相符，表明kan抗性成功替換spvBC基因，即獲得完全重組菌SL1344-ΔspvBC∷kan（圖1-B）。

2.3 kan抗性基因的消除及spvBC敲除株的鑒定

將完全重組的陽(yáng)性菌落SL1344-ΔspvBC∷kan涂布于Kan 平板純化3 次后于42℃培養(yǎng)過(guò)夜，篩選出KanRAmpS菌落即為消除pKD46 的陽(yáng)性菌落。電轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pCP20，篩選出AmpRKanS菌落即為消除Kan 抗性的陽(yáng)性菌落SL1344-ΔspvBC∷FRT。再將其42℃培養(yǎng)16 h，篩選出AmpSKanS菌落即為消除質(zhì)粒pCP20 的spvBC基因敲除株SL1344-ΔspvBC。連續(xù)3 次傳代后，利用引物P3、P4進(jìn)行PCR 鑒定，kan基因消除后敲除株中片段大小為356 bp。瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增產(chǎn)物大小與理論值相符，表明成功構(gòu)建spvBC基因敲除株SL1344-ΔspvBC（圖1-B）。

2.4 spvBC基因的擴(kuò)增

以鼠傷寒沙門菌野生株SL1344 全基因組DNA為模板，利用引物spvBC-F（XhoI）及spvBC-R（EcoR I）PCR 擴(kuò)增含酶切位點(diǎn)的spvBC基因片段，相應(yīng)引物擴(kuò)增的spvA、spvB、spvC和spvD基因片段作為對(duì)照。PCR 擴(kuò)增目的產(chǎn)物片段大小應(yīng)為2 789 bp。瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增產(chǎn)物大小與理論值相符，表明成功擴(kuò)增出含酶切位點(diǎn)得spvBC基因片段（圖1-C）。

2.5 pBAD-spvBC重組質(zhì)粒的構(gòu)建

spvBC基因片段和質(zhì)粒pBAD 經(jīng)XhoI 和EcoR I 雙酶切后切膠回收，回收產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化。隨機(jī)挑選單菌落，利用引物spvBC-F（XhoI）和spvBC-R（EcoR I）進(jìn)行菌落PCR，10 號(hào)為鑒定出的陽(yáng)性菌落（圖1-D）。將該菌落PCR 反應(yīng)產(chǎn)物送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GeneBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中spvBC序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明pBAD-spvBC重組質(zhì)粒的構(gòu)建成功。

圖1 spvBC 基因編輯株的構(gòu)建

2.6 鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvBC回補(bǔ)株蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

以鼠傷寒沙門菌回補(bǔ)株SL1344-c-spvBC作為受試菌，敲除株SL1344-ΔspvBC做陰性對(duì)照，SL1344-c-spvB作陽(yáng)性對(duì)照。經(jīng)不同濃度L-阿拉伯糖誘導(dǎo)后Western blot 檢測(cè)SpvB 蛋白（約68 kD）表達(dá)水平。結(jié)果表明，13 mmol/L L-阿拉伯糖誘導(dǎo)后，回補(bǔ)株SL1344-c-spvBC中SpvB 蛋白正常表達(dá)（圖2-A）。以鼠傷寒沙門菌回補(bǔ)株SL1344-c-spvBC作為受試菌，野生株SL1344-WT 及敲除株SL1344-ΔspvBC做陰性對(duì)照。經(jīng)不同濃度L-阿拉伯糖誘導(dǎo)后Western blot 檢測(cè)回補(bǔ)株SpvC 蛋白上特有的His 標(biāo)簽（約30 kD）。結(jié)果表明，13 mmol/L L-阿拉伯糖可誘導(dǎo)回補(bǔ)株SL1344-c-spvBC中SpvC 蛋白正常表達(dá)（圖2-B）。以上結(jié)果表明，鼠傷寒沙門菌回補(bǔ)株SL1344-c-spvBC中SpvB 及SpvC 蛋白L-阿拉伯糖適宜誘導(dǎo)濃度為13 mmol/L。

圖2 spvBC 回補(bǔ)株蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

3 討論

研究細(xì)菌基因功能的方法主要有基因敲除、反義RNA 干擾、轉(zhuǎn)座子插入突變、基因過(guò)表達(dá)等，但因其余方法影響因素較多、插入位點(diǎn)不特異和篩選方法繁瑣等缺點(diǎn)，基因敲除成為較可靠而常用的手段［22］。λRed 重組系統(tǒng)來(lái)自λ 噬菌體，克服了大腸桿菌自身核酸外切酶降解線性DNA 的缺陷，可實(shí)現(xiàn)幾乎任何位點(diǎn)的基因修飾，且在子代中穩(wěn)定遺傳［23］。此外，λRed 重組系統(tǒng)不必依賴于酶切連接等傳統(tǒng)的基因工程手段，達(dá)到近乎“無(wú)痕”的敲除效果。1998 年，Murphy 等［24］首次利用Red 重組系統(tǒng)在大腸桿菌中進(jìn)行基因敲除，由此在原核生物中建立了新的基因編輯技術(shù)。隨后廣泛應(yīng)用于大腸桿菌染色體基因的敲除［18］，也有文獻(xiàn)報(bào)道其用于沙門菌染色體基因的敲除［25］，本實(shí)驗(yàn)室前期利用λRed 重組系統(tǒng)成功敲除鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvC，但未用于長(zhǎng)約2.8 kb 的大片段基因的敲除［26］。本研究利用λRed 重組系統(tǒng)敲除鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒上的大片段毒力基因spvBC，為研究大片段基因的功能提供工具，也為該系統(tǒng)在細(xì)菌質(zhì)粒基因上的應(yīng)用提供思路。

影響Red 同源重組效率的因素包括線性DNA的濃度、同源片段的長(zhǎng)度、錯(cuò)配序列及內(nèi)源性核酸酶等［27］。其中同源臂長(zhǎng)度對(duì)重組效率至關(guān)重要。在大腸埃希菌中，同源臂從20 bp 增加至40 bp，同源重組效率呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，而同源臂從40 bp 增加至1 000 bp，同源重組效率只增加10 倍。同源臂為40-50 bp 同源打靶片段即可進(jìn)行高效率的重組［28］。有報(bào)道稱600-1 000 bp 的同源臂，特別適用于鼠疫耶爾森菌大片段（2-47 kb）的基因敲除［29］。本研究發(fā)現(xiàn)，在本實(shí)驗(yàn)條件下，鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒毒力基因同源臂長(zhǎng)度為50 bp 即可發(fā)生高效重組，既降低實(shí)驗(yàn)成本，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作又保證了敲除效率。本研究基于λRed 重組系統(tǒng)構(gòu)建鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvBC敲除株，為研究鼠傷寒沙門菌spvBC大片段基因的致病機(jī)制提供有力的工具。

原核生物中外源基因的存在猶如細(xì)胞內(nèi)多拷貝質(zhì)粒一樣，對(duì)宿主是一種代謝負(fù)擔(dān)。當(dāng)外源基因片段較大且表達(dá)特異蛋白時(shí)，這種代謝壓力就變得更加嚴(yán)重。研究人員將幽門螺旋桿菌HopE基因克隆到pBAD 載體上構(gòu)建基因修飾菌，其編碼外膜蛋白HopE 能穩(wěn)定表達(dá)并保持較高拷貝數(shù)［30］。本研究利用pBAD 原核表達(dá)載體成功構(gòu)建spvBC回補(bǔ)株，初步摸索了該系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)條件，優(yōu)化回補(bǔ)株蛋白SpvB及SpvC L-阿拉伯糖誘導(dǎo)濃度。L-阿拉伯糖適宜誘導(dǎo)濃度為13 mmol/L，低濃度（1.3 mmol/L）L-阿拉伯糖誘導(dǎo)后SpvB 及SpvC 蛋白難以充分表達(dá)，而L-阿拉伯糖濃度較高（120 mmol/L）則抑制細(xì)菌生長(zhǎng)［31］。

鼠傷寒沙門菌經(jīng)糞口途徑傳播，在腸道內(nèi)繁殖，粘附于腸黏膜上皮細(xì)胞，進(jìn)而侵入固有層，釋放毒素，導(dǎo)致其充血、水腫、點(diǎn)狀出血等急性炎癥反應(yīng)［32］。本課題組新近研究表明，鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB通過(guò)核因子E2 相關(guān)因子2（Nuclear factor erythroid-derived 2-related factor 2，NRF2）調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的鐵穩(wěn)態(tài)從而影響細(xì)菌的胞內(nèi)繁殖［33］。spvC可引起感染的免疫細(xì)胞逆向遷移進(jìn)入血液，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)菌的遠(yuǎn)處播散，導(dǎo)致敗血癥［34］。已知除鼠傷寒沙門菌外，其他致病沙門菌也大都含有spv基因，以上研究提示spvB及spvC作為沙門菌保守的毒力因子，在細(xì)菌的免疫逃逸和應(yīng)對(duì)宿主固有免疫應(yīng)答具有重要的作用。然而spvB與spvC的關(guān)系及其在感染進(jìn)程中的互作仍需進(jìn)一步探究。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvBC敲除株和回補(bǔ)株，為后續(xù)深入研究spvB和spvC各自功能及其互作提供可利用的工具，也為其他原核生物的基因修飾提供科學(xué)依據(jù)和思路。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分別利用λRed 重組系統(tǒng)和pBAD 原核表達(dá)載體構(gòu)建鼠傷寒沙門菌spvBC基因敲除株及回補(bǔ)株，并發(fā)現(xiàn)13 mmol/L 的L-阿拉伯糖為誘導(dǎo)鼠傷寒沙門菌spvBC回補(bǔ)株中SpvB 及SpvC 蛋白正常表達(dá)的適宜濃度。鼠傷寒沙門菌spvBC基因編輯株的成功構(gòu)建為原核細(xì)胞大片段基因的編輯提供了參考策略，也為后續(xù)探究spvB和spvC在沙門菌致病中的功能提供可利用的工具菌株。