陳中 盧星宇

（1. 中山大學化學學院，廣州 510275；2. 西湖大學分子科學公共實驗平臺 浙江省功能分子精準合成重點實驗室，杭州 310024）

蛋白質(zhì)是由氨基酸經(jīng)“脫水縮合”的方式組成的多肽經(jīng)過折疊形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，是構(gòu)成生物體的三大基礎(chǔ)物質(zhì)之一，機體所有重要的組成部分都需要蛋白質(zhì)的參與。人體內(nèi)蛋白質(zhì)都是由20 種氨基酸按不同比例組合而成，但是性質(zhì)和生物功能各不相同，其原因與蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。確定蛋白質(zhì)構(gòu)象最準確的方法是X-射線晶體衍射［1-6］，但對結(jié)構(gòu)復雜、柔性的生物大分子蛋白質(zhì)來說，得到所需的晶體結(jié)構(gòu)較為困難。二維、多維核磁共振技術(shù)能測出溶液狀態(tài)下較小蛋白質(zhì)的構(gòu)象［3，7-9］，可是對分子量較大的蛋白質(zhì)的計算處理非常復雜。近十多年來，冷凍電鏡發(fā)展迅速，成為蛋白結(jié)構(gòu)解析的利器，在生命科學領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了很多重大科學成果的突破［10-12］，然而其價格非常昂貴，機時緊張，需要非常專業(yè)的技術(shù)人員，尚不足以滿足大量課題組的需求。

通過測量蛋白質(zhì)的CD 譜，能夠分析和計算出蛋白質(zhì)大分子的二級結(jié)構(gòu)組成，方法簡單、快捷，廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)折疊，蛋白質(zhì)構(gòu)象研究，酶動力學等領(lǐng)域［4-5，13-18］。如圖1 所示，圓二色光譜的遠紫外波段，近紫外波段及可見波段分別可以研究蛋白的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)及金屬蛋白復合結(jié)構(gòu)的相互作用。通常蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)都會在CD 譜的紫外區(qū)段（180-260 nm）有明顯的信號，主要生色團是肽鏈，這一波長范圍的CD 譜包含了生物大分子主鏈構(gòu)象的信息。如表1 所示，主要構(gòu)象包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、P2 結(jié)構(gòu)及無規(guī)卷曲。

蛋白質(zhì)在一定的物理和化學條件（加熱、加壓、脫水、振蕩、紫外線照射、超聲波、強酸、強堿、尿素、重金屬鹽、十二烷基硫酸鈉）下，其空間構(gòu)象容易發(fā)生改變而失活，因此研究蛋白的構(gòu)象和構(gòu)型變化對其功能和應(yīng)用有重要的價值。蛋白質(zhì)的變性作用主要是由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)被破壞。天然蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)是通過氫鍵等次級鍵維持的，而變性后次級鍵被破壞，蛋白質(zhì)分子就從原來有序的卷曲的緊密結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o序的松散的伸展狀結(jié)構(gòu)（但一級結(jié)構(gòu)并未改變）。熱變性是蛋白質(zhì)變性中最常見的一類現(xiàn)象，圓二色光譜的變溫檢測可以研究蛋白熱變性過程，并通過擬合直接獲取蛋白質(zhì)的熱變性中點溫度Tm 值和記錄整個熱變性過程，對研究蛋白組分的熱穩(wěn)定性及在外界環(huán)境改變時的變性過程具有重要的科學價值。

本實驗開發(fā)一種測定蛋白二級結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定性的正交方法，以在180-260 nm 范圍內(nèi)的圓二色全光譜熱變性測試來考察蛋白質(zhì)構(gòu)象隨溫度的變化而改變的全過程。同之前的單波長法相比，本方法的操作難度沒有增加，耗時和樣品量保持一致，避免了單波長如何選點的問題，通過一次測量，既觀測了各個波長的圓二色信號隨溫度變化的曲線，也觀測了圓二色光譜在程序升溫過程中的各個溫度點的變化，從而更全面地觀測蛋白質(zhì)的整體結(jié)構(gòu)熱變性過程，這是單波長法無法觀測到的信息。

圖1 圓二色光譜用于蛋白結(jié)構(gòu)的分析

表1 蛋白二級結(jié)構(gòu)空間構(gòu)象的CD 譜分析

1 材料與方法

圓二色光譜儀采用英國應(yīng)用光物理公司Applied Photophysics Ltd 的Chirascan-V100。牛血清蛋白（CAS號：9048-46-8）和血紅蛋白（CAS 號：9008-02-0）來自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。配溶液用的純水來自屈臣士純凈水。圓二色光譜檢測用的比色皿的光程為0.5 mm。

2 結(jié)果

下面以牛血清蛋白（BSA）和血紅蛋白（HGB）為例，用全光譜正交法來分析蛋白樣品的熱變性過程。

2.1 蛋白熱變性實驗的濃度優(yōu)化

為了選擇合適的蛋白濃度進行熱變性實驗，配置了從0.01-1 mg/mL 的5 種濃度的蛋白，分別測試它們的吸光度值和CD 值。

如圖2 所示，當?shù)鞍诐舛仍?.1-0.5 mg/mL 時，吸光度值在0.4-2 左右，此區(qū)間是測試CD 譜的合適范圍，對應(yīng)的CD 譜曲線除強度不同，形狀完全一致。當?shù)鞍诐舛鹊陀?.01 mg/mL，曲線已不能準確看出蛋白結(jié)構(gòu)。當?shù)鞍诐舛仍? mg/mL 的量級上，其吸光度在3.5 左右，吸光度值過高導致圓二色光譜不能準確檢測，在CD 譜上可見180 nm 附近的曲線方向與其他3 個稍有不同。將有CD 信號的4 個濃度的蛋白進行熱變性實驗。同時監(jiān)控它們的吸光度和CD 譜曲線的變化。

圖2 BSA 蛋白的不同濃度的吸光度（A）和圓二色光譜（B）

通過圖3 的吸光度曲線分析，可以看出BSA蛋白的吸光度在0.1 mg/mL 和0.25 mg/mL 時隨著溫度的升高變化較小，在0.5 mg/mL 時變化較大，而1 mg/mL 時變化明顯。圖4 的CD 譜曲線表明當?shù)鞍诐舛刃∮? mg/mL 時，蛋白的熱變性趨勢接近一致，而1 mg/mL 的蛋白由于吸光度較大，CD 譜曲線在高吸光度區(qū)域出現(xiàn)大幅度震蕩的噪音信號，顯示其不是適于進行蛋白二級結(jié)構(gòu)的檢測的合適濃度，所以測試蛋白的熱變性過程的濃度在0.1-0.5 mg/mL為宜。

2.2 蛋白熱變性構(gòu)象的軟件分析

當測完一組蛋白的熱變性實驗后，通過Global3熱力學分析軟件，如圖5 的每一個圖都有6 個窗口，從左上方到右下方可以得到以下信息：（1）每個波長的圓二色變溫曲線；（2）特征溫度點的圓二色圖譜（如起始圖譜、變性中點溫度的圖譜）；（3）溫度-波長CD 三維圖；（4）計算出的濃度分布作為溫度的函數(shù)；（5）噪音三維圖；（6）計算出的熱力學參數(shù)（Tm 值和構(gòu)象的焓變）。前5 個窗口根據(jù)每個波長的變溫曲線，逐步計算出此蛋白的Tm值，同時也證實此分析結(jié)果的可靠性發(fā)現(xiàn)，3 種適合濃度BSA 的Tm 值都在65.5℃；所以只要吸光度在合理的區(qū)間（0.2 ＜ A ＜ 3），Tm 值不受濃度的影響。

圖4 BSA 蛋白4 種濃度熱變性的CD 譜

圖5 Global3 軟件分析BSA 蛋白3 種濃度熱變性結(jié)果

除了熱變性分析軟件，使用CDNN 軟件做蛋白構(gòu)象的擬合分析，從蛋白熱變性過程的圓二色譜中的選取3 個溫度的波長曲線：起始溫度點（20℃），中間溫度點（56℃）和最終溫度點（96℃），用軟件計算其蛋白的二級結(jié)構(gòu)。圖6 的結(jié)果可以看到，BSA 蛋白最初的狀態(tài)是螺旋態(tài)為主，隨著溫度的逐漸升高，CD 譜的強度下降，螺旋結(jié)構(gòu)向轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲逐漸變化，具體表現(xiàn)為構(gòu)象從α 螺旋向β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化，說明隨著溫度的上升，蛋白構(gòu)象的總體變化是一個從有序到無序的過程，最終無規(guī)卷曲所占的比例最大。

圖6 BSA 蛋白構(gòu)象CDNN 軟件分析結(jié)果

2.3 其他蛋白的熱變性測試分析

除了BSA 蛋白外，還用血紅蛋白（Hemoglobin，HGB）進行熱變性實驗，根據(jù)上述測試結(jié)果，血紅蛋白的濃度選用0.25 mg/mL 進行測試。

測試結(jié)果如圖7 所示，相比于BSA 血清蛋白，血紅蛋白的熱變性過程更加明顯，當溫度在96℃時，蛋白的CD 信號非常微弱，劇烈的熱變性過程表明此蛋白對于溫度變化更加敏感。從圖8 的Global 3軟件可以分析出此血紅蛋白的Tm 值55.9℃，略低于前面的血清蛋白，也說明血紅蛋白的熱穩(wěn)定性相對血清蛋白較低。圖9 的CDNN 的分析結(jié)果與血清蛋白類似，隨著溫度上升，同樣是發(fā)生從α 螺旋向β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的構(gòu)象轉(zhuǎn)化。

2.4 單波長測試對比

作為對比，采用單波長法重復上面的實驗。以BSA（0.25 mg/mL）為例，進行一組蛋白熱變性單波長法的測試。如圖10 和表2 所示，根據(jù)全譜曲線選出3 個極值點（191 nm、208 nm、222 nm），一個隨機點（235 nm），一個端點（260 nm）和一個特殊的交叉點（203 nm），分別做6 個單波長蛋白熱變性曲線。數(shù)據(jù)經(jīng)擬合圖10 所示，在所有的極值點的Tm值都在65-66℃，中間隨機點也在65-66℃，端點有兩個值分別在的在54℃和80℃附近，特殊交叉點在52℃左右。所以單波長測試與選取的波長位置有很大關(guān)系，選取的3 個極值點的結(jié)果都是一致的，與全譜所測的Tm 值基本一致，因為極值點反應(yīng)的是蛋白構(gòu)象對溫度最敏感的部分，中間任意點只要有足夠的變化，也能正確反應(yīng)熱變性的過程，只有變化特別小的特殊點和幾乎不變化的端點會給出錯誤信息（擬合的曲線方程不相同），所以采用單波長測試時宜選擇變化大的點更能反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的真實信息。

圖7 血紅蛋白熱變性測試結(jié)果

圖8 Global3 軟件分析HGB 蛋白熱變性的結(jié)果

3 討論

蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性探索是研究蛋白功能及開發(fā)新藥物的一個重要環(huán)節(jié)。相比于復雜昂貴的核磁、XRD 及冷凍電鏡，圓二色光譜是一種相對簡單的手段，在研究蛋白質(zhì)折疊，蛋白質(zhì)構(gòu)象領(lǐng)域非常必要，不同于傳統(tǒng)的單波長法，熱變性過程中只求得蛋白的Tm 值信息，效率非常低下。本研究成功構(gòu)建了蛋白二級結(jié)構(gòu)的正交方法，追蹤各個溫度下的蛋白結(jié)構(gòu)變化過程，覆蓋了蛋白熱變性過程中的非常全面的信息。

本實驗首先通過4 組濃度梯度的測試，優(yōu)化出蛋白的熱變性過程的適宜濃度為0.1 mg-0.5 mg。從蛋白的熱變性全譜中，選取了BSA 蛋白變溫過程中的3 組曲線，發(fā)現(xiàn)蛋白的構(gòu)象從α 螺旋向β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化，說明隨著溫度的上升，蛋白構(gòu)象的總體變化是一個從有序到無序的過程，最終無規(guī)卷曲所占的比例最大。用HGB 進行重復實驗得到相似的實驗結(jié)果，充分證明了實驗設(shè)計的可靠性。這些分析結(jié)果是用熱變性單波長法無法實現(xiàn)的。此外，這種全譜測試方法，在藥物開發(fā)如生物類似藥Biosimilar 的開發(fā)過程中，可以同步觀測生物類似藥與參比藥物的結(jié)構(gòu)變化過程的一致性，非常適合于藥物篩選。

為了驗證本方法所測試Tm 值的可靠性，將相同的BSA 蛋白用單波長法分別進行蛋白熱變性的6組實驗發(fā)現(xiàn)，當波長取在極值點和變化大的點所測試的Tm 值結(jié)果和全譜法完全一致，而波長取在變化小的端點和交叉點與本研究結(jié)果差別較大，而且擬合曲線也不正常。所以相比于單波長，本方法既不需要對波長的選取有任何顧慮，又綜合了熱變性過程中所有的結(jié)構(gòu)變化的信息，所得的分析結(jié)果也是最全面，最準確的。

圖9 HbC 蛋白構(gòu)象CDNN 軟件分析結(jié)果

4 結(jié)論

本實驗基于蛋白的熱穩(wěn)定性測試開發(fā)了一種全光譜的正交方法，通過與單波長法的對比，我們發(fā)現(xiàn)當吸光度在合理的范圍內(nèi)，兩種方法都能正確地測試出蛋白的熱變性溫度（Tm 值），且Tm 值不受濃度的影響。全光譜法測試所花的時間和單波長法測試的時間是一樣的，單波長測試觀測某一特定波長的變化，所得的信息有限；而全光譜法能反應(yīng)蛋白在所有波長段的熱穩(wěn)定性狀況，所得的結(jié)構(gòu)信息更完整，包括各種螺旋、折疊結(jié)構(gòu)等隨溫度的變化情況，有利于了解蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)的整體熱變性過程，將對蛋白藥物的穩(wěn)定性監(jiān)控和藥物篩選提供更全面信息。

圖10 六個代表性點的熱變性過程的溫度-CD 強度圖

表2 六個代表性點的熱變性過程的溫度-CD 強度的擬合方程和擬合結(jié)果