王綠陽(yáng) 康翠翠 馮江銀 丁立人 杭蘇琴

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家動(dòng)物消化道營(yíng)養(yǎng)國(guó)際聯(lián)合研究中心 江蘇省消化道營(yíng)養(yǎng)與動(dòng)物健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 消化道微生物研究室，南京 210095；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)類國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，南京 210095）

胃腸道受到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)刺激后能夠分泌一系列胃腸激素調(diào)節(jié)機(jī)體的食欲、消化吸收和代謝等［1］，因此近年來(lái)被廣泛研究。目前研究胃腸激素分泌的模型包括內(nèi)分泌細(xì)胞系、體外腸道灌流、腸道組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和超高顯微鏡的使用等［2］。其中，腸道組織培養(yǎng)因樣本易獲取、操作方便快捷而被廣泛應(yīng)用。相比于內(nèi)分泌細(xì)胞系培養(yǎng)，腸道組織培養(yǎng)能夠保證細(xì)胞所處的環(huán)境基本保持完整，并能保留細(xì)胞極性［3］。同時(shí)，它可以用來(lái)研究營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)胃腸激素分泌的影響及機(jī)制，因此被認(rèn)為是研究胃腸激素分泌的一種有效的方法。

目前，組織灌流培養(yǎng)和組織靜態(tài)培養(yǎng)是腸道組織培養(yǎng)中最常見的兩種方法。其中，灌流能使培養(yǎng)物處于不斷更新的環(huán)境中，從而消除了細(xì)胞代謝產(chǎn)物及激素的反饋?zhàn)饔?，并能使培養(yǎng)物接受不同頻率、強(qiáng)度和時(shí)間的刺激處理，故適于研究激素釋放動(dòng)力學(xué)及分泌和調(diào)節(jié)機(jī)制的研究［4］。但相比于靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)，組織灌流培養(yǎng)可能會(huì)抑制組織和培養(yǎng)液之間大分子物質(zhì)的相互交換［5］。這兩種組織培養(yǎng)方法各有利弊，但目前對(duì)于它們?cè)谖改c激素分泌中的比較研究還未見報(bào)道。同時(shí)，目前哺乳動(dòng)物腸道組織培養(yǎng)的形式主要是組織塊培養(yǎng)和機(jī)械破碎培養(yǎng)［6-7］，不同組織形態(tài)對(duì)胃腸激素分泌影響的研究也有待探討。

因此，本研究以豬十二指腸組織為研究材料，選用L- 精氨酸（L-arginine，L-Arg）作為刺激物［8-9］首先比較不同組織形態(tài)對(duì)膽囊收縮素（Cholecystokinin，CCK）的影響，確定適用于研究激素分泌的組織形態(tài)。在此基礎(chǔ)上通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)液CCK 和乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）的水平，比較體外組織灌流培養(yǎng)與靜態(tài)培養(yǎng)對(duì)組織激素分泌和活性的影響。最后，通過(guò)在體十二指腸灌注實(shí)驗(yàn)比較體內(nèi)外CCK 分泌的差異，進(jìn)一步確定更適合用于體外胃腸激素分泌研究的方法。該研究將為選取合適的方法進(jìn)行體外胃腸激素的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

L-精氨酸（A0013，純度≥99.0%）購(gòu)自索萊寶科技（中國(guó)，北京），KHB 溶液（4.02 mmol/L KCl，136.87 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L CaCl2，2.10 mmol/L MgCl2，25.18 mmol/L HEPES，pH = 7.2-7.4），0.01 mol/L PBS（135 mmol/L NaCl，8 mmol/L K2HPO4，2.7 mmol/L KCl，1.5 mmol/L KH2PO4，pH = 7.2），生理鹽水，細(xì)胞培養(yǎng)板（12 孔），5 mL 真空采血管EDTA-K2（YA1291）購(gòu)自索萊寶科技（北京）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集及處理 豬十二指腸組織均采集于江蘇省南京市某屠宰場(chǎng)，均為體重100-130 kg 的杜×長(zhǎng)×大商品豬。屠宰后，立即采集長(zhǎng)約6 cm的近端十二指腸，放置于充滿95% O2和5% CO2的預(yù)冷的KHB 緩沖液中，于1 h 內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，立即將組織置于無(wú)菌操作臺(tái)中，按照Wang 等［9］的描述，剪取長(zhǎng)4 cm 左右的腸段，除去腸系脂肪并剝離組織層后，立即剖開并用預(yù)冷的0.01 mol/L PBS 溶液漂洗組織，無(wú)菌條件下利用打孔器剪取直徑8 mm 大小的組織用于組織完整培養(yǎng)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步剪碎使其直徑小于1 mm 用于組織剪碎培養(yǎng)。每3 塊組織塊（直徑8 mm 或1 mm，來(lái)自3 頭豬）分別裝進(jìn)組織灌流系統(tǒng)的若干尼龍袋內(nèi)或者每孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。每次試驗(yàn)中所用到的樣品至少來(lái)自于3 頭豬的十二指腸組織，試驗(yàn)之間的十二指腸組織切割部位及長(zhǎng)度基本保持一致。

1.2.2 十二指腸組織灌流培養(yǎng) 利用本實(shí)驗(yàn)室已建立并運(yùn)行的表面灌流系統(tǒng)進(jìn)行組織灌流實(shí)驗(yàn)，詳見Zhao 等［8］的描述。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)需要將灌流小室由5 mL 注射器改換為2 mL。試驗(yàn)開始前，通過(guò)蠕動(dòng)泵將含有95% O2和5% CO2氣體的KHB 溶液引入到灌流小室，水浴鍋預(yù)熱使灌流小室液體溫度達(dá)到37℃。豬十二指腸組織制備好后，放入灌流小室，調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵速率為6 mL/h，用KHB 溶液預(yù)灌流30 min 使所有組織處于同一狀態(tài)。之后，將KHB 溶液更換為含有0、10、20 及50 mmol/L L-Arg 的KHB溶液進(jìn)行正式組織灌流培養(yǎng)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)束收集的培養(yǎng)液4℃，10 000 r/min 離心5 min，并收集上清液放入-20℃以下進(jìn)行后續(xù)CCK 和LDH 的測(cè)定。

1.2.3 十二指腸組織靜態(tài)培養(yǎng) 將組織放入每孔含有2 mL KHB 溶液的12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱（95% O2，5% CO2）進(jìn)行30 min 預(yù)培養(yǎng)。之后，將KHB 溶液含有0、10、20 及50 mmo/L L-Arg 的KHB 溶液（每孔2 mL）。試驗(yàn)結(jié)束收集的培養(yǎng)液4℃，10 000 r/min 離心5 min，并收集上清液-20℃保存，用于后續(xù)CCK 和LDH 的測(cè)定。

1.2.4 體內(nèi)十二指腸灌注實(shí)驗(yàn) 選取體重相近（25±0.2）kg、安裝十二指腸T 型瘺管的42 日齡杜×長(zhǎng)×大三元雜交保育豬6 頭，隔夜禁食。實(shí)驗(yàn)前將其麻醉。按照Steinert 等［10-11］的描述，將6.75 g L-Arg 溶進(jìn)240 mL 生理鹽水（0.45 kcal/min，1 g 氨基酸提供4 kcal 熱量），利用本實(shí)驗(yàn)室的蠕動(dòng)泵，以4 mL/min 的速度向十二指腸灌注L-Arg 溶液。其中，-15 min 至0 min 灌注生理鹽水，自0 min 開始灌注L-Arg 溶液，每10 min 于耳緣靜脈采血（圖1）。血液4℃，3 000 r/min 離心15 min，收集上清液-80℃保存，用于后續(xù)CCK 濃度的測(cè)定。

圖1 體內(nèi)十二指腸灌注實(shí)驗(yàn)程序圖

1.2.5 指標(biāo)測(cè)定

1.2.5.1 激素測(cè)定 利用豬膽囊收縮素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（ANG-31022P，南京奧青）檢測(cè)培養(yǎng)液上清CCK 的濃度。CCK 試劑盒檢測(cè)濃度范圍為10-200 ng/L，批間變異系數(shù)＜ 15%，批內(nèi)變異系數(shù)＜ 9%。

1.2.5.2 組織活力檢測(cè) 利用乳酸脫氫酶試劑盒（A020-2，南京建成）檢測(cè)培養(yǎng)液上清LDH 的濃度。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016 處理后，采用SPSS 23.0 軟件單因素方差分析模型（One-way ANOVA）中的Turkey test 進(jìn)行多重比較，P＜ 0.05代表差異顯著。試驗(yàn)結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1 組織灌流培養(yǎng)對(duì)CCK分泌的影響

由圖2 可知，與0 mmol/L L-Arg 組相比，20 和50 mmol/L L-Arg 均顯著刺激豬十二指腸組織分泌CCK（P＜0.05），而10 mmol/L L-Arg 對(duì)CCK 的分泌無(wú)顯著影響（P＞0.05）。此外，不同濃度L-Arg 刺激下，組織機(jī)械破碎培養(yǎng)CCK 的分泌均顯著低于組織塊培養(yǎng)。結(jié)果表明，組織形態(tài)影響組織灌流培養(yǎng)時(shí)CCK的分泌。

圖2 組織灌流培養(yǎng)對(duì)CCK 分泌的影響

2.2 靜態(tài)組織培養(yǎng)對(duì)CCK分泌的影響

由圖3 可知，與0 mmol/L L-Arg 組相比，10、20 和50 mmol/L L-Arg 均刺激豬十二指腸組織分泌CCK（P＜0.05）。此外，不同濃度L-Arg 刺激下，組織機(jī)械破碎培養(yǎng)CCK 的分泌均顯著低于組織塊培養(yǎng)（P＜0.05），說(shuō)明組織形態(tài)影響組織靜態(tài)培養(yǎng)時(shí)CCK的分泌。

2.3 不同培養(yǎng)方式下組織CCK分泌的動(dòng)態(tài)過(guò)程

根據(jù)圖2 和圖3 可知，組織灌流培養(yǎng)與靜態(tài)培養(yǎng)中顯著刺激CCK 分泌所需L-Arg 的濃度不同。故進(jìn)一步觀測(cè)1 h 內(nèi)CCK 分泌的動(dòng)態(tài)變化。由圖4 可知，與0 min 相比，組織灌流培養(yǎng)下CCK 濃度在10 min 達(dá)到顯著水平（P＜0.05），之后隨時(shí)間增長(zhǎng)呈平穩(wěn)波動(dòng)；而靜態(tài)培養(yǎng)條件下CCK 濃度在20 min 時(shí)達(dá)到顯著水平（P＜0.05），并隨時(shí)間增長(zhǎng)呈累積效應(yīng)。結(jié)果表明，這兩種不同組織培養(yǎng)方法影響CCK 的變化水平。

圖3 組織靜態(tài)培養(yǎng)對(duì)CCK 分泌的影響

圖4 不同培養(yǎng)方式下CCK 的分泌過(guò)程

2.4 不同培養(yǎng)方式下LDH分泌的動(dòng)態(tài)過(guò)程

由圖5 可知，在1 h 的培養(yǎng)過(guò)程中，組織灌流培養(yǎng)的LDH 濃度隨時(shí)間增長(zhǎng)而逐漸降低，而組織靜態(tài)培養(yǎng)的LDH 濃度則逐漸升高。結(jié)果表明，這兩種不同組織培養(yǎng)方法影響培養(yǎng)液LDH 的水平。

圖5 不同培養(yǎng)方式下LDH 分泌的動(dòng)態(tài)過(guò)程

2.5 體內(nèi)灌流實(shí)驗(yàn)中血漿CCK分泌的動(dòng)態(tài)過(guò)程

由圖6 可知，與0 min 相比，血液CCK 濃度在20 min 時(shí)顯著升高（P＜0.05），之后隨時(shí)間增長(zhǎng)呈平穩(wěn)波動(dòng)。

圖6 體內(nèi)灌流實(shí)驗(yàn)中血漿CCK 分泌的動(dòng)態(tài)過(guò)程

3 討論

體外組織灌流培養(yǎng)作為離體組織動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的一種方法，近年來(lái)在內(nèi)分泌研究中得到廣泛應(yīng)用。例如，Callwaere 等［12］利用體外灌流系統(tǒng)研究趨化因子SDF-1（Stromal cell-derived factor 1）對(duì)下丘腦抗利尿激素釋放的影響。本實(shí)驗(yàn)室利用建立的體外組織灌流培養(yǎng)系統(tǒng)，研究了不同氨基酸包括L-Phe、L-Trp 和L-Arg 等對(duì)胃腸激素如CCK、生長(zhǎng)抑素（Somatostatin，SS） 和抑胃肽（Gastric inhibitory peptide，GIP）等分泌的影響及潛在機(jī)制［9，13-14］。近來(lái)，Le Thuc 等［15］又建立了一種體外組織灌流系統(tǒng)用于研究下丘腦神經(jīng)肽的釋放。研究表明，體外組織灌流培養(yǎng)已被廣泛用于激素分泌的研究。相比于組織灌流培養(yǎng)，組織靜態(tài)培養(yǎng)也是一種研究激素分泌的有效方法。例如，Voortman［16］和Tian 等［17］分別利用該方法研究了脂肪酸和支鏈氨基酸對(duì)胃腸激素分泌的影響。

體外培養(yǎng)組織時(shí)對(duì)組織的處理方法并不一致，因此本研究首先比較了不同組織形態(tài)對(duì)CCK 分泌的影響。結(jié)果表明，無(wú)論是組織灌流培養(yǎng)還是組織靜態(tài)培養(yǎng)，機(jī)械破碎法處理的組織分泌CCK 的能力均顯著降低，這可能是因?yàn)闄C(jī)械破碎法對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷大［18］，使得一些內(nèi)分泌細(xì)胞被破壞而削弱了組織分泌激素的能力。因此，機(jī)械破碎法不適合用于胃腸激素分泌的研究。但是，機(jī)械破碎法是分離和培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的有效方法［19-20］。與組織塊培養(yǎng)法相比，機(jī)械破碎法顯著縮短了乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，且細(xì)胞增殖旺盛、雜質(zhì)細(xì)胞少、遷出速度快。因此，不同實(shí)驗(yàn)具有不同的特點(diǎn)，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的組織處理方法。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)組織灌流培養(yǎng)和靜態(tài)培養(yǎng)中CCK 分泌達(dá)到顯著水平所需的L-Arg 濃度不同（分別為20 mmol/L 和10 mmol/L）。研究表明，L-Arg 刺激CCK 的分泌主要是由胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞膜上的G 蛋白偶聯(lián)型受體及胞內(nèi)的一系列信號(hào)分子所介導(dǎo)［21］。其中，Wang 等［9］發(fā)現(xiàn)鈣敏感受體（Calcium sensing receptor，CaSR）以及下游的磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）和腺苷酸環(huán)化酶（Adenylate cyclase，AC）共同參與L-Arg 刺激豬十二指腸CCK分泌的過(guò)程。同時(shí)，10 mmol/L L-Arg 可以顯著刺激小鼠結(jié)腸L 細(xì)胞分泌胃腸激素胰高血糖素樣肽-1（Glucagon-like peptide 1，GLP-1）和酪酪肽（Peptide YY，PYY）［22］，因此推測(cè)L-Arg 刺激胃腸激素分泌的最低濃度可能是10 mmol/L。為解釋不同培養(yǎng)方法中CCK 顯著分泌所需L-Arg 濃度的差異，本研究進(jìn)一步檢測(cè)1 h 內(nèi)CCK 分泌的動(dòng)態(tài)變化。發(fā)現(xiàn)組織灌流培養(yǎng)中CCK 濃度在10 min 達(dá)到顯著水平，之后隨時(shí)間增長(zhǎng)呈波動(dòng)變化；而靜態(tài)培養(yǎng)條件中CCK 濃度在20 min 時(shí)達(dá)到顯著水平，并隨時(shí)間增長(zhǎng)呈累積效應(yīng)。這可能與培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)液流動(dòng)與否有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中組織灌流速度為6 mL/h，該速度與前人研究一致［14-15］，說(shuō)明該速度適用于組織灌流培養(yǎng)。但有研究表明，8 mL/h 的速度灌流培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞，細(xì)胞活力顯著低于4 mL/h 和2 mL/h［23］，這可能與試驗(yàn)所用組織部位不同有關(guān)。此外，由于灌流培養(yǎng)能夠及時(shí)更新細(xì)胞培養(yǎng)液并排出有毒代謝產(chǎn)物，近年來(lái)該方法也被用于細(xì)胞培養(yǎng)的研究［24］。

LDH 是代表組織損傷程度的一個(gè)重要指標(biāo)。作為胞內(nèi)的酶，正常情況下由于細(xì)胞膜的屏障作用不易逸出；但當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，細(xì)胞膜通透性會(huì)增加導(dǎo)致胞內(nèi)LDH 釋放到培養(yǎng)液中［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，組織灌流培養(yǎng)的LDH 濃度隨時(shí)間增長(zhǎng)而逐漸降低，而組織靜態(tài)培養(yǎng)的LDH 濃度則逐漸升高，這表明組織灌流培養(yǎng)更能保存組織的活性。但是，兩種培養(yǎng)方式下所用的L-Arg 濃度不同（分別為20 mmol/L 和10 mmol/L）因此L-Arg 濃度可能也是影響組織LDH分泌的因素之一。研究表明，這兩種培養(yǎng)方式均能夠在短時(shí)間培養(yǎng)中保存腸道組織的活性，但相比于靜態(tài)培養(yǎng)，組織灌流培養(yǎng)更能保存組織的活性與完整性［26］。

體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ投际菫榱吮M可能地接近和模擬體內(nèi)的環(huán)境。因此，進(jìn)一步利用豬在體十二指腸灌注L-Arg，檢測(cè)血液CCK 分泌的動(dòng)態(tài)變化，比較十二指腸組織體外與體內(nèi)CCK 分泌的異同。由于無(wú)法確定豬十二指腸L-Arg 的濃度范圍，同時(shí)考慮到體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性，故無(wú)法直接根據(jù)體外試驗(yàn)的L-Arg濃度進(jìn)行在體十二指腸灌注。但有研究顯示，攝食后每小時(shí)大約有200 kcal 的熱量到達(dá)十二指腸［27］，因此根據(jù)營(yíng)養(yǎng)素的熱量開展實(shí)驗(yàn)更合適。考慮到豬和人胃腸道的生理具有很高的相似性［28］，因此本研究根據(jù)Steinert 等［10-11］對(duì)人體十二指腸氨基酸灌注的描述開展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。在1 h 的灌注過(guò)程中，血液CCK 濃度在20 min 時(shí)顯著升高，之后隨時(shí)間增長(zhǎng)呈波動(dòng)變化。這與人體十二指腸氨基酸灌注引起的CCK 的分泌過(guò)程相似［10］，同時(shí)也與本研究的組織灌流培養(yǎng)中CCK 的變化非常相似。這表明組織灌流培養(yǎng)在一定程度上可以反映體內(nèi)CCK 的分泌過(guò)程。同時(shí)組織靜態(tài)培養(yǎng)中CCK 濃度所呈累積式增長(zhǎng)能反映一定時(shí)間內(nèi)組織分泌激素的總水平。因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康目梢赃x擇不同的實(shí)驗(yàn)方法。

4 結(jié)論

本研究首先通過(guò)比較組織塊和剪碎兩種培養(yǎng)形態(tài)對(duì)CCK 分泌的影響，證明組織塊更適用于研究CCK 的分泌。在此基礎(chǔ)上通過(guò)體內(nèi)外試驗(yàn)比較組織灌流培養(yǎng)和靜態(tài)培養(yǎng)對(duì)十二指腸CCK 分泌和組織活性的影響。結(jié)果表明，組織灌流培養(yǎng)在一定程度上更符合體內(nèi)CCK 的分泌過(guò)程，而且更能保存組織的活性；但組織靜態(tài)培養(yǎng)更能一定程度上反映組織激素分泌的總水平。因此，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的組織體外培養(yǎng)方法。