馬旭輝 陳茹梅 柳小慶 趙軍 張霞

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

玉米是我國(guó)第一大糧食作物，2019 年種植面積達(dá)4.13×108hm2，總產(chǎn)量達(dá)2.61×108t，種植面積和總產(chǎn)量均位居全球第二，僅次于美國(guó)。我國(guó)玉米增產(chǎn)對(duì)整個(gè)糧食作物增產(chǎn)的貢獻(xiàn)率達(dá)到將近60%，居糧食作物之首，在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有舉足輕重的地位，因此玉米的穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)是保障國(guó)家糧食安全及相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)。玉米是一種對(duì)水分敏感的作物，在生長(zhǎng)發(fā)育過程中對(duì)水的需求都比較大，苗期干旱會(huì)造成玉米營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)緩慢，花期干旱會(huì)影響花器官的分化和生長(zhǎng)，導(dǎo)致散粉和吐絲間隔延長(zhǎng)，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。在過去25 年里，干旱使全球玉米產(chǎn)量減少40%左右［1］。在水資源匱乏，氣候變化加劇，耕地面積不斷減少的大環(huán)境下，為保證玉米穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)，必須采取多種措施提高玉米作物抗旱性。目前提高農(nóng)作物的抗旱性主要采取兩種方式，一是加強(qiáng)土壤管理，通過引水澆灌，秸稈還田，深耕土壤等方式；二是通過常規(guī)的雜交育種和基因工程手段培育優(yōu)良的抗旱品種。目前出現(xiàn)了新的方式提高植物對(duì)干旱脅迫的耐受力，即使用一些化學(xué)制劑（包括亞硝基氰化鈉，過氧化氫，硫氫化鈉，多胺，褪黑素等）可以提高植物對(duì)不同非生物脅迫的耐受力，改善細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和植物生長(zhǎng)，這些化學(xué)試劑被稱為誘發(fā)劑（Priming）［2］。因此，尋找合適的植物誘發(fā)劑來提高作物的抗旱性是提高作物產(chǎn)量的有效途徑之一。

褪黑素，化學(xué)名稱為N-乙酰-5-甲氧基色胺（N-acetyl-5-methoxy-tryptamine），是一種吲哚色胺。1958 年，Lerner 等［3］首次從牛的松果體中提取出褪黑素，隨后，研究人員陸續(xù)在不同的生物體中發(fā)現(xiàn)褪黑素的存在，且Tan 等［4］從藻類中分離并鑒定出了褪黑素，證實(shí)了植物界中也存在有褪黑素，表明了褪黑素廣泛存在于生物體內(nèi)。據(jù)報(bào)道，褪黑素參與動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育方面也起著關(guān)鍵作用，包括營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、種子萌發(fā)、生根和開花等過程［5-6］。由于褪黑素參與了許多植物的發(fā)育過程和逆境反應(yīng)。2018 年，Kanwar 等［7］對(duì)褪黑素在光合作用中的作用、脅迫下的植物激素相互作用、細(xì)胞氧化還原信號(hào)以及在植物免疫、植物修復(fù)和植物微生物相互作用中的其他調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了全面綜述，認(rèn)為雖然植物褪黑素是一種獨(dú)立的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可以與其他植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或激素相互作用，但它是否可以作為一種完整的植物激素，目前仍有待確定［7］。

根系，作為“承上啟下”的主要營(yíng)養(yǎng)器官，發(fā)揮著固持植物體地上組織和汲取地下水分和養(yǎng)分的雙重功能，在植物整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。同時(shí)，植物根系也是感知土壤水分匱缺的第一“信使”，能夠?qū)⑼寥浪旨梆B(yǎng)分的信息快速傳遞到地上部分，使地上組織作出反應(yīng)，參與植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫反應(yīng)［8］。根系的構(gòu)型，特指植物根群組成的具有生物功能的復(fù)雜的根系空間結(jié)構(gòu)和形態(tài)，即各級(jí)根軸之間精細(xì)的空間擴(kuò)展方式［9］。根系構(gòu)型包括根體積、根長(zhǎng)、根直徑、根總重、根冠比等，主要由遺傳因素決定，同時(shí)受土壤介質(zhì)環(huán)境、種植密度、植株大小和農(nóng)業(yè)耕作等因素影響。它可以決定植物對(duì)水分和營(yíng)養(yǎng)的吸收，從而影響植物地上部分的生長(zhǎng)和抗旱性，對(duì)于維持植物在干旱條件下的產(chǎn)量也十分重要。玉米根系屬于須根系，按照根系類型建成的發(fā)育階段可以將玉米根系分成：種子萌發(fā)時(shí)形成的的種子根（Seminal root）或主根（Primary roots）、莖生的節(jié)根（Crown roots）和氣生根（Brace roots）以及著生于這些根上的側(cè)生根（Lateral roots）［10］。其中主根形成于胚根鞘，種子根形成于中胚軸盾片，且主根會(huì)在玉米生長(zhǎng)后期發(fā)生退化。初生根系、次生根系和氣生根系交錯(cuò)分布，共同構(gòu)成玉米強(qiáng)大而密集的根系系統(tǒng)。玉米在水分脅迫下，根系構(gòu)型、內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)滲調(diào)物質(zhì)的積累會(huì)發(fā)生一系列適應(yīng)性改變，如改變根重和側(cè)根數(shù)量、根冠比加大，從而影響地上植株的生長(zhǎng)發(fā)育，最終影響玉米產(chǎn)量。研究表明，外源添加500 μmol/L褪黑素可以顯著促進(jìn)黃瓜側(cè)根的生長(zhǎng)［11］。Zhang等［12］通過GO 和通路富集分析（Pathway enrichment analysis）發(fā)現(xiàn)褪黑素促進(jìn)黃瓜側(cè)根發(fā)育的主要作用機(jī)制是激活根系中相關(guān)激素和轉(zhuǎn)錄因子通路，減少根系發(fā)育過程中因呼吸作用產(chǎn)生的ROS 損傷。這些研究結(jié)果表明褪黑素可以促進(jìn)一些植物根系的發(fā)育，但是褪黑素促進(jìn)根系發(fā)育的具體機(jī)制目前還不清楚。

褪黑素已被證明可以增強(qiáng)植物的非生物脅迫能力，包括干旱脅迫、高溫脅迫、低溫脅迫、鹽脅迫、重金屬脅迫等［13-16］。Zhang 等［17］詳細(xì)的介紹了植物在惡劣環(huán)境條件下褪黑激素的調(diào)節(jié)作用。環(huán)境脅迫可以增加植物內(nèi)源性褪黑激素的水平。褪黑激素生物合成基因的過表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因植物的褪黑素水平，且這些轉(zhuǎn)基因植物對(duì)非生物脅迫表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性。同時(shí)外源褪黑素的施加也能提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受能力。褪黑素介導(dǎo)基因RsMT1（Metallothionein 1）的上調(diào)，增強(qiáng)煙草植物對(duì)Cd 的耐受性［18］。Yang 等［19］通過轉(zhuǎn)錄組分析表明，外源褪黑素主要通過調(diào)控參與光合作用、ROS 代謝、類黃酮和褪黑激素生物合成的基因來增強(qiáng)抗氧化保護(hù)，提高橡樹（Hevea brasiliensis）耐鹽脅迫能力。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫條件下，經(jīng)褪黑素處理的黃瓜（Cucumis sativusL.）植株種子萌發(fā)率和根系生長(zhǎng)率較高［11］，褪黑素還能改善葡萄插穗時(shí)的干旱脅迫［20］。在擬南芥中過表達(dá)褪黑素受體（AtPMTR1），導(dǎo)致氣孔關(guān)閉，提高水分利用效率和耐旱性［21］。雖然已有多項(xiàng)研究表明，使用褪黑素可以提高作物的抗旱性，但對(duì)其提高農(nóng)作物抗旱性的具體作用機(jī)制卻知之甚少。

因此，本研究采取根灌褪黑素和褪黑素浸種兩種外源施用方法，通過萌發(fā)紙水培培養(yǎng)和土培盆栽的兩種種植方法，探索PEG 誘導(dǎo)的干旱脅迫和土壤控水兩種旱處理?xiàng)l件下，外源褪黑素的施用對(duì)玉米幼苗根系發(fā)育和抗旱性影響的具體表現(xiàn)，深入了解褪黑素改善植物抗旱性的的生理和生化機(jī)制，旨為大田中褪黑素的施用方法提供新的借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 種子 玉米B73 自交系（2017 年10 月收于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊實(shí)驗(yàn)基地）。

1.1.2 試劑 褪黑素（購買于Sigma，配制方法：將褪黑素用無水乙醇稀釋至100 mmol/L，作為儲(chǔ)液保存在-20℃冰箱中），營(yíng)養(yǎng)液（Hoagland Modified Basal Salt Mixture，H353，Phytotechlab），PEG6000，磷酸緩沖液，過氧化氫（H2O2）含量測(cè)定試劑盒（南京建成公司），過氧化物酶（POD）試劑盒（南京建成公司），丙二醛（MDA）含量測(cè)定試劑盒（南京建成公司），超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒（南京建成公司），BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（索萊寶公司），過氧化氫酶（CAT）活性檢測(cè)試劑盒（南京建成公司），硝基藍(lán)四唑（NBT）（Amresco，0.1 g NBT溶于50 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液中），營(yíng)養(yǎng)土。

1.1.3 儀器和工具 萌發(fā)紙（購買于Anchor Paper

公司），恒溫培養(yǎng)箱（LHS-80），便攜式光合系統(tǒng)CIRAS-3（PP Systems，Amsbury，MA，USA A）儀器，植物效率分析儀（Handy PEA，Handy Plant Efficiency Analyzer），SPAD-502 meter（Konica Minolta，Japan）葉綠素含量測(cè)定儀，A3 尺寸平板掃描儀（MICROTEK Plantom，9900XL），萬深LA-S 系列植物圖像分析系統(tǒng)-根系分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 浸種盆栽法 用6%次氯酸鈉溶液清洗種子20 min達(dá)到滅菌的效果，在蒸餾水中漂洗5次后風(fēng)干。滅菌后的種子放入不同濃度（0 μmol/L，50 μmol/L，500 μmol/L）的褪黑素溶液中1 min，濾紙也用同樣濃度褪黑素溶液潤(rùn)濕后置于14 cm 的培養(yǎng)皿中，然后將處理過的種子置于用相同濃度褪黑素浸濕的濾紙上，在27℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。種子萌發(fā)后移栽至盆中。這些種子分為兩組，第一組將0 μmol/L濃度褪黑素浸泡的種子和50 μmol/L 濃度褪黑素浸泡的種子（每種濃度9 粒種子）栽在長(zhǎng)方形的裝滿營(yíng)養(yǎng)土的塑料容器（長(zhǎng)50 cm，寬30 cm，深15 cm）。第二組將0 μmol/L 濃度褪黑素浸泡的種子和500 μmol/L 濃度褪黑素浸泡的種子（每種濃度9 粒種子）栽在相同的塑料容器中。這些植株平均地生長(zhǎng)在溫室中。當(dāng)幼苗發(fā)育出四片完全的葉子（處于V4 生長(zhǎng)階段）時(shí)，通過停止灌溉使它們處于漸進(jìn)的缺水狀態(tài)，直到觀察到明顯的葉片萎縮，此時(shí)土壤含水量接近于0。然后進(jìn)行相關(guān)生理生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2 水培根灌法 我們基于水培根灌法來評(píng)估外源性褪黑素的施加對(duì)根系構(gòu)型發(fā)育的影響。將已消毒的種子放在雙層棕色萌發(fā)紙上，然后卷起來，并垂直放置在2 L 的燒杯中，加入400 mL 的營(yíng)養(yǎng)液，置于光照恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)生長(zhǎng)（培養(yǎng)條件是28℃，16 h 光照，100 μmol/（m2·s）光照強(qiáng)度；22℃，8 h 黑暗；濕度60%）。種子在萌發(fā)紙上萌發(fā)5 d 后，發(fā)芽卷紙被分為4 組，包括對(duì)照組（只添加營(yíng)養(yǎng)液），試驗(yàn)組I（營(yíng)養(yǎng)液+15% PEG6000），試驗(yàn)組II（營(yíng)養(yǎng)液+1 μmol/L 褪黑素），試驗(yàn)組III（營(yíng)養(yǎng)液+15% PEG6000+1 μmol/L 褪黑素）。所有幼苗再培養(yǎng)7 d，然后收集根系和地上部分，進(jìn)行根系構(gòu)型分析和生理生化實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)液每?jī)商旄鼡Q一次。

1.2.3 玉米根系構(gòu)型分析 手動(dòng)對(duì)玉米根系構(gòu)型進(jìn)行分析，包括主根長(zhǎng)度，側(cè)根數(shù)目和種子根長(zhǎng)度等。隨后，將幼苗根系放置在掃描儀上，使其漂浮在A3尺寸平板掃描儀的丙烯酸托盤中的水中，避免根系重疊和交叉。通過萬深LA-S系列植物圖像分析系統(tǒng)-根系分析系統(tǒng)分析，獲得根系的長(zhǎng)度，表面積，體積和平均直徑等。對(duì)4 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的所有植株根系構(gòu)型都進(jìn)行測(cè)量，每個(gè)實(shí)驗(yàn)有32 株玉米幼苗。

1.2.4 葉片氣體交換參數(shù)、葉綠素?zé)晒夂腿~綠素含量的測(cè)定 利用便攜式光合系統(tǒng)儀器測(cè)定植物的氣體交換參數(shù)。當(dāng)土壤中種植的植物葉片發(fā)生萎蔫時(shí)，在上午（10：00-12：00）時(shí)間對(duì)植株的第4 片葉子進(jìn)行氣體交換參數(shù)測(cè)量。同時(shí)，使用植物效率分析儀和SPAD 葉綠素儀在相同葉片上測(cè)定葉綠素?zé)晒夂腿~綠素含量。每片葉子進(jìn)行了3 次獨(dú)立的測(cè)量后取平均值。每個(gè)處理?xiàng)l件下測(cè)定5 株植株。

1.2.5 測(cè)定葉片相對(duì)含水量（RWC）和地上及地下部分干重 在進(jìn)行了上述的光合作用測(cè)量之后，采集相同的葉片，按照Turner 中描述的方法對(duì)葉片的相對(duì)含水量進(jìn)行測(cè)定［22］。從葉中脈和邊緣之間的區(qū)域剪下5 cm2的葉片樣本（避免使用大葉脈），并將其置于預(yù)先稱重的密封的小瓶中進(jìn)行稱重，獲得葉片的新鮮重量（FW），然后在室溫下將其浸入蒸餾水中8 h，稱量獲得葉片的飽和重量（TW）。樣品在80℃下烘干24 h，稱量獲得葉片的干重（DW）。葉片RWC 根據(jù)以下公式進(jìn)行計(jì)算。

對(duì)于盆栽的植物，取得所有地上組織并烘干3 d（85℃），以確定地上所有部分干重。對(duì)水培紙卷培養(yǎng)的植株，將根系部分和地上部分進(jìn)行分離然后測(cè)定。每個(gè)處理收集9 個(gè)樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)量。

1.2.6 活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）測(cè)定 根據(jù)H2O2測(cè)定試劑盒中所述的方法測(cè)定葉片過氧化氫（H2O2）的含量。根據(jù)脂質(zhì)過氧化（MDA）檢測(cè)試劑盒的方法測(cè)定MDA 的含量。采用原位組織化學(xué)染色方法檢測(cè)超氧陰離子（O2-）的積累。取離體葉片真空浸于NBT 溶液中，放置于25℃黑暗中2 h，然后將樣品取出在95%乙醇煮沸去除葉綠素，并拍照記錄。

1.2.7 抗氧化酶的活性測(cè)定 取0.1 g 葉片樣品在冰態(tài)磷酸鹽緩沖液中研磨，獲得組織勻漿。然后將組織勻漿在4℃下，以4 000 r/min 離心10 min，取上清液進(jìn)行抗氧化酶活性的測(cè)定。其中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定使用的是BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒。超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定使用的是超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒，過氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定使用的是過氧化氫酶（CAT）活性檢測(cè)試劑盒，過氧化物酶（POD）活性測(cè)定采用過氧化物酶（POD）活性檢測(cè)試劑盒。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)分析采用方差分析（ANOVA）和最小顯著性差異（LSD）檢驗(yàn)，采用SPSS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 褪黑素促進(jìn)玉米生長(zhǎng)發(fā)育

水培條件下對(duì)玉米植株根部直接施加褪黑素。對(duì)地上部分的表型進(jìn)行觀察，正常條件下，褪黑素的施加對(duì)植物地上部分的生長(zhǎng)發(fā)育沒有影響。在干旱條件下，植物的生長(zhǎng)受到抑制，褪黑素的施加緩解了這種抑制（圖1-A）。在盆栽種植條件下，對(duì)玉米植株采用種子浸泡褪黑素方法。對(duì)地上部分的表型進(jìn)行觀察，正常條件下，施加褪黑素對(duì)植物地上部分的生長(zhǎng)發(fā)育影響不顯著。在干旱條件下，植物的生長(zhǎng)受到抑制，褪黑素的施加緩解了這種抑制（圖1-B）。對(duì)玉米的根系和地上部分生物量進(jìn)行測(cè)定，采用根灌褪黑素的方法，在正常條件下，褪黑素的施加對(duì)植物的地上部分生物量沒有明顯影響，但施加褪黑素的植株根系生物量為0.077 6 g，未施加褪黑素的植株根系生物量為0.061 5 g，褪黑素的施加顯著提高玉米幼苗的根系發(fā)育。在PEG6000 誘導(dǎo)的干旱脅迫條件下，施加褪黑素的植株無論是地上部分還是根系，生物量都顯著高于未施加褪黑素的植株（圖1-C）。采用種子浸泡褪黑素的方法，在正常條件下和干旱脅迫條件下，施加褪黑素的植株地上部分生物量顯著高于未施加褪黑素的植株，其中干旱條件下不同濃度（0 μmol/L vs 50 μmol/L vs 500 μmol/L）褪黑素浸種的玉米幼苗地上部分的生物量分別為0.353 g、0.492 g 和0.307 g（圖1-D）。

圖1 水培根灌和浸種盆栽兩種外源褪黑素施加方式對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響

2.2 外源褪黑素促進(jìn)玉米根系發(fā)育

我們總共測(cè)量了11 個(gè)根系參數(shù)，并分為3 大類，包括總根，主根和種子根。如表1 所示，玉米根系構(gòu)型的特征包括根的長(zhǎng)度、數(shù)量、表面積、體積等。選取了具有代表性的正常條件下和PEG 誘導(dǎo)的干旱條件下的根系掃描圖像（圖2），施加褪黑素的植株在正常條件和PEG 誘導(dǎo)的干旱條件下根系比未施加的植株更龐大強(qiáng)壯。

對(duì)玉米幼苗根系的掃描圖像進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算出11 個(gè)性狀的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，并進(jìn)行ANOVA 分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2 和表3 所示。正常條件下施加褪黑素的植株根系和對(duì)照組有顯著性的差異。施加褪黑素的玉米根系在長(zhǎng)度，表面積，體積，以及側(cè)根的數(shù)目等都顯著高于未施加褪黑素的玉米植株。其中差異性最明顯的主要表現(xiàn)在主根的長(zhǎng)度（PRL），主根的體積（PRV）以及主根上側(cè)根的數(shù)目（LRNPR）。相比于未施加褪黑素的植株根系，施加褪黑素的植株根系PRL 提高了37%，PRV 增加了6%，LRNPR增加了15%。PEG6000誘導(dǎo)的干旱條件下，玉米幼苗的根系發(fā)育受到的一定的抑制，在根系直接添加褪黑素可以緩解根系發(fā)育受到的抑制。其中未施加褪黑素的植株總根長(zhǎng)（TRL）下降了29.71%，總根表面積（TSA）下降了42.3%，總根體積（TRV）下降了41.1%。施加褪黑素的植株TRL 只下降了12.1%，TSA 下降了5.8%，TRV 下降了16.8%。

2.3 干旱條件下外源褪黑素的施加減少ROS和MDA的積累

對(duì)水培植株的葉片、根系和盆栽植株的葉片采用組織化學(xué)染色和分光光度法分析兩種主要活性氧（O2-和H2O2）以丙二醛（MDA）的含量。干旱條件下，外源褪黑素的施加能夠降低O2-在葉片中的積累（圖3-A，3-B）。正常澆水條件下，直接添加褪黑素和種子浸泡褪黑素兩種施加方式對(duì)植物葉片和根系中H2O2的含量的無明顯影響。干旱條件下葉片和根系都表現(xiàn)出明顯的H2O2積累，根灌褪黑素和種子浸泡褪黑素兩種施加方式都顯著減少了H2O2的積累（圖3-C，3-D），其中根灌褪黑素幼苗的葉片和根系中H2O2的含量相比未施加褪黑素的植株分別下降了34.3%，36.59%。不同濃度（0 μmol/L、50 μmol/L 和500 μmol/L）褪黑素浸種的幼苗葉片中H2O2的含量分別是4.676 μmol/g、3.196 μmol/g 和3.168 μmol/g。

在正常條件下，采取上述兩用方式施加褪黑素對(duì)丙二醛含量沒有影響，但是干旱條件會(huì)導(dǎo)致葉片和根系中MDA 的積累，褪黑素的施加會(huì)降低MDA 的含量，減少M(fèi)DA 的積累（圖3-E，3-F）。干旱條件下，根灌褪黑素幼苗的葉片和根系中MDA 的含量相比未施加褪黑素的植株分別下降了38.6%，29.5%。 不 同 濃 度（0 μmol/L、50 μmol/L、500 μmol/L）褪黑素浸種的幼苗葉片中H2O2的含量分別是2.117 nmol/g、1.451 nmol/g 和1.435 nmol/g。

表1 玉米根系構(gòu)型構(gòu)相關(guān)特征概述

圖2 具有代表性的正常條件下和PEG6000 誘導(dǎo)的干旱條件下的根的掃描圖像

表2 正常條件下水培根灌褪黑素對(duì)根系構(gòu)型相關(guān)性狀影響的統(tǒng)計(jì)總結(jié)

表3 PEG6000 誘導(dǎo)的干旱脅迫條件下水培添加褪黑素對(duì)根系構(gòu)型相關(guān)性狀影響的統(tǒng)計(jì)總結(jié)

2.4 外源褪黑素提高玉米幼苗的相對(duì)含水量（RWC）

如圖4-A，使用卷紙水培法，在正常條件下，褪黑素的施加對(duì)植株葉片的相對(duì)含水量沒有明顯的影響，而在PEG6000 誘導(dǎo)的干旱脅迫條件下，葉片的相對(duì)含水量會(huì)降低，褪黑素的施加會(huì)抑制相對(duì)含水量的下降，施加褪黑素的植株相對(duì)含水量為85.9%，未施加褪黑素的植株相對(duì)含水量為63.6%。同樣在盆栽條件下，干旱脅迫8 d 后，經(jīng)褪黑素處理的植株相對(duì)含水量顯著高于未處理的植株。未處理植株的相對(duì)含水量是46.56%，50 μmol/L 褪黑素處理的植株葉片的相對(duì)含水量是50.83%，500 μmol/L褪黑素處理的植株葉片的相對(duì)含水量是50.43%（圖4-B）。

2.5 干旱條件下外源褪黑素增強(qiáng)玉米的抗氧化系統(tǒng)

測(cè)定兩種褪黑素施加方法在正常條件下和干旱脅迫條件下對(duì)植物抗氧化酶（POD、CAT、SOD）的活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在水分充足的條件下，兩種外源褪黑素的施加都對(duì)抗氧化酶的活性沒有明顯的影響。PEG6000 誘導(dǎo)的干旱脅迫條件和自然干旱條件會(huì)導(dǎo)致抗氧化酶活性的增加，其中根灌褪黑素的植物葉片中SOD、CAT 和POD 活性比未施加褪黑素的植株分別提高了9.34%、14.62%、8.48%，根系中SOD、CAT 和POD 活性分別提高了9.65%、27.21%、10.89%。種子浸泡褪黑素的植株葉片SOD、CAT 和POD 活性同樣高于種子未浸泡褪黑素的植株（ 圖5），0 μmol/L、50 μmol/L、500 μmol/L濃度褪黑素處理?xiàng)l件下盆栽植物葉片的SOD 活性為4.348 U/mL、5.4 U/mL、5.39 U/mL、CAT 活性為46.885 U/（mg protein）、54.23 U/（mg protein）、52.39 U/（mg protein），POD 活性為113.85 U/（mg protein）、139.91 U/（mg protein）、138.52 U/（mg protein）。

2.6 干旱條件下外源褪黑素的施加提高玉米幼苗的光合作用

測(cè)量氣體交換參數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，褪黑素的施加對(duì)正常條件下的氣體交換參數(shù)影響不顯著。在干旱脅迫條件下，蒸騰速率、光合速率和氣孔導(dǎo)度均顯著降低。然而，褪黑素的應(yīng)用在一定程度上抑制了這種下降。干旱脅迫條件下，褪黑素處理的玉米幼苗葉片氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率和光合速率均高于未處理的玉米幼苗（圖6-A，6-B，6-C）。0 μmol/L、50 μmol/L、500 μmol/L 濃度褪黑素處理的植物葉片氣孔導(dǎo)度分別為41.25 mmol/（m2·s）、50.625 mmol/（m2·s）、51.25 mmol/（m2·s），蒸騰速率分別為1.307 mmol/（m2·s）、2.285 mmol/（m2·s）、2.236 mmol/（m2·s），光合速率分別為11.96 μmol/（m2·s）、14.68 μmol/（m2·s）和13.8 μmol/（m2·s）。

測(cè)定玉米葉片的葉綠素濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在正常條件下，葉片葉綠素濃度（以SPAD 的形式評(píng)估）不受褪黑素施加的影響。經(jīng)過8 d 的干旱脅迫后，葉綠素濃度明顯降低，0 μmol/L、50 μmol/L、500 μmol/L 濃度褪黑素處理的植物葉片葉綠素濃度分別為36.115、45.975 和45.575，即褪黑素處理的幼苗葉綠素濃度高于未處理的幼苗（圖6-D）。

對(duì)玉米葉片的葉綠素?zé)晒膺M(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在正常澆水條件下，施加褪黑素對(duì)玉米葉片的葉綠素?zé)晒鉀]有顯著的影響。在干旱脅迫下，植物葉片的葉綠素?zé)晒鈺?huì)顯著下降，0 μmol/L、50 μmol/L 和500 μmol/L 濃度褪黑素處理的植物葉片葉綠素?zé)晒庵捣謩e為0.608、0.671 和0.657，所以經(jīng)過褪黑素浸種的植株葉綠素?zé)晒獾南陆档玫搅嗣黠@地抑制（圖6-E）。

3 討論

眾所周知，非生物脅迫可以抑制作物的生長(zhǎng)、發(fā)育和生產(chǎn)。最近的研究表明，一些化合物可以使植物更好地抵抗非生物脅迫。褪黑素是一種新型的植物激素和啟動(dòng)劑，2008 年，Wei 等［23］在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)植物褪黑素的受體（CAND2/PMTR1），研究發(fā)現(xiàn)植物褪黑素通過阻止H2O2和Ca2+信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)異源三聚體G 蛋白α 亞單位的調(diào)節(jié)，與CAND2/PMTR1受體結(jié)合，導(dǎo)致氣孔關(guān)閉。據(jù)報(bào)道，褪黑素在植物生長(zhǎng)和發(fā)育的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，且能減輕非生物脅迫引起的氧化損傷［24］。顯然，這些生理過程可能通過尚未確定的植物受體/其他結(jié)合生物分子進(jìn)行調(diào)控，需要對(duì)受體依賴的植物褪黑素信號(hào)在其他生理過程中的作用進(jìn)行深入研究。

圖3 水培根灌和浸種盆栽兩種褪黑素處理方式對(duì)ROS 和MDA 含量的影響

圖4 水培根灌和浸種盆栽兩種褪黑素處理方式對(duì)植株葉片相對(duì)含水量的影響

植物通過改變水分利用減少干旱脅迫造成的不良影響。地上部分通過氣孔控制蒸騰來減少水分損失，地下部分則不斷擴(kuò)大強(qiáng)壯根系來保持足夠的水分吸收。發(fā)達(dá)的根系是植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和果實(shí)發(fā)育的基礎(chǔ)。近年來，植物根系已成為國(guó)內(nèi)外許多研究的中心問題。根系的生物量、長(zhǎng)度、密度和深度等性狀是干旱環(huán)境下影響最終產(chǎn)量的主要抗旱性狀［25-26］。深的根系有助于從相當(dāng)深的土壤中提取水分［27］。根是植物適應(yīng)干旱的重要器官，深的根系使玉米能夠獲得土壤深處的水分，這被認(rèn)為是決定玉米抗旱性的重要因素。在許多植物中，褪黑素已被證明能促進(jìn)根的生長(zhǎng)。外源性褪黑素對(duì)野生芥菜黃化幼苗的刺激作用表現(xiàn)出濃度依賴性。0.1 mmol/L褪黑素的應(yīng)用也提高了芥菜根中內(nèi)源性游離吲哚乙酸的水平［28］。在甜櫻桃砧木的實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了類似的效應(yīng)，低濃度的褪黑素對(duì)砧木的根數(shù)和根長(zhǎng)有自生反應(yīng)，而高濃度的褪黑素對(duì)所有的砧木都有生根抑制作用［29］。但是這種差別反應(yīng)的機(jī)制仍然未知。Zhou 等［30］研究發(fā)現(xiàn)GmDREB1在轉(zhuǎn)基因植物中可以調(diào)節(jié)褪黑素的合成，增加褪黑素的含量，從而減輕干旱脅迫對(duì)根系發(fā)育的抑制作用。在本研究中，通過對(duì)植株根系形態(tài)的對(duì)比分析，結(jié)果表明外源褪黑素的施加可以促進(jìn)主根的伸長(zhǎng)和增加側(cè)根的數(shù)量，增大根系的表面積、體積，使其擁有更豐富的根系。在PEG 誘導(dǎo)的干旱條件下，施加褪黑素能使受到抑制的植株根系生長(zhǎng)得到緩解。同時(shí)褪黑素的施用減輕了干旱脅迫對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的抑制程度。結(jié)果表明，褪黑素可能通過調(diào)節(jié)根系生長(zhǎng)提高植物抗旱性，但是具體的機(jī)制還需要有進(jìn)一步的研究。

圖5 水培根灌和浸種盆栽兩種褪黑素處理方式對(duì)玉米植株抗氧化酶活性的影響

圖6 褪黑素浸種對(duì)氣體交換參數(shù)，葉綠素含量，葉綠素?zé)晒庖约跋鄬?duì)含水量的影響

為了減少干旱脅迫誘導(dǎo)的ROS 積累，植物進(jìn)化了出一系列復(fù)雜的酶和非酶防御系統(tǒng)來抵御氧化損傷［31］。植物細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)包括酶性抗氧化劑（POD、CAT、SOD、APX、GPX、GR 和DHAR）和非酶性抗氧化劑。許多研究發(fā)現(xiàn)抗氧化酶活性可以響應(yīng)滲透脅迫［32］，外源褪黑素可以調(diào)節(jié)一些抗氧化酶活性來緩解脅迫誘導(dǎo)的植物活性氧的積累［33-34］。先前的研究表明，外源褪黑素可以誘導(dǎo)內(nèi)源一氧化氮的產(chǎn)生［35］，一氧化氮（NO）已經(jīng)成為植物中一種重要的信號(hào)分子，因此，一氧化氮是褪黑素增強(qiáng)非生物脅迫的耐受性所必需的，其可下調(diào)miR398 表達(dá)以激活ROS 清除酶活性并促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)并最終清除細(xì)胞內(nèi)ROS［36］。在小麥中，褪黑素處理可清除活性氧積累，并通過刺激抗氧化酶和增加抗氧化劑來減輕鋁誘導(dǎo)的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化損傷［37］。MzASMT1在擬南芥中的過表達(dá)顯著降低了活性氧的產(chǎn)生，且植物比野生型植株表現(xiàn)出更好的抗旱能力［38］。同時(shí)，植物褪黑素還可以提高細(xì)胞器的抗氧化能力，調(diào)節(jié)C-重復(fù)序列結(jié)合因子（CBFs）等逆境反應(yīng)基因的表達(dá)，從而提高植物在受到各種非生物逆境脅迫時(shí)的抗逆性［39-40］。這些研究都表明，抗氧化酶活性響應(yīng)滲透脅迫，褪黑素可以調(diào)節(jié)部分抗氧化酶活性，緩解植物在干旱脅迫下誘導(dǎo)的ROS 的積累［33-34］。在本研究中，直接施加褪黑素和褪黑素浸種兩種方法都提高了根系和葉片的抗氧化酶（包括SOD、CAT 和POD）的活性，減少了H2O2和MDA 的積累，這些結(jié)果與先前大豆的研究是一致的，褪黑素可以直接清除ROS，還可以促進(jìn)其他抗氧化劑和抗氧化酶的積累，間接清除ROS，從而調(diào)節(jié)玉米幼苗細(xì)胞的氧化平衡，維持細(xì)胞內(nèi)ROS 濃度，防止活性氧積累，從而減少干旱脅迫對(duì)膜脂質(zhì)過氧化造成的損害，提高玉米幼苗的抗旱性。2019 年Arnao 等［41］提出了一個(gè)模型，認(rèn)為植物褪黑素的作用都與氧化還原網(wǎng)絡(luò)的不同調(diào)節(jié)元件（如活性氧ROS 和活性氮RNS）通過H2O2和NO的作用聯(lián)系在一起。ROS、RNS 和植物褪黑素形成了一個(gè)三聯(lián)體，調(diào)節(jié)植物體中的氧化還原網(wǎng)絡(luò)，但是這些元件如何在不同的生理情況下調(diào)節(jié)氧化還原動(dòng)態(tài)平衡目前還不清楚。

光合作用是植物利用光能驅(qū)動(dòng)有機(jī)化合物合成的物理化學(xué)過程，是植物生產(chǎn)的基礎(chǔ)。干旱是一種嚴(yán)重的抑制光合作用的環(huán)境脅迫。通常認(rèn)為，水分脅迫下光合速率下降的主要原因是由氣孔關(guān)閉引起的環(huán)境CO2擴(kuò)散到羧化部位的限制。褪黑素可以作為光合作用和氣孔導(dǎo)度的增強(qiáng)劑或保護(hù)劑，上調(diào)光系統(tǒng)、電子轉(zhuǎn)運(yùn)體和ATP 酶基因的許多元素。褪黑素處理植株表現(xiàn)出凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、光系統(tǒng)II 量子效率和光合電子傳遞速率的增加。褪黑素還通過調(diào)節(jié)保衛(wèi)細(xì)胞陰離子通道蛋白和脫水蛋白來優(yōu)化惡劣條件下的氣孔功能，增加氣孔張開程度，增加二氧化碳的利用率。在Calvin 循環(huán)中，褪黑素調(diào)節(jié)Rubisco 元件、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和糖酶的表達(dá)。此外，ASC-GSH 循環(huán)、TCA 循環(huán)以及肌醇和脂肪酸生物合成途徑的元素也受到褪黑素的調(diào)節(jié)［42］。已有研究表明，在干旱條件下，褪黑素處理的蘋果幼苗保持了顯著較高的CO2同化率和氣孔導(dǎo)度，與未經(jīng)處理的蘋果相比，褪黑素處理的蘋果在干旱脅迫下保持了較高的光合速率［29］。同時(shí)干旱脅迫通常會(huì)導(dǎo)致葉片中PSII 的損傷［20，43-46］。氣孔是植物葉片進(jìn)行氣體交換的主要通道，在光合作用和呼吸作用中起著重要的作用。褪黑素的應(yīng)用提高了蘋果和葡萄的氣孔導(dǎo)度［47］。在本研究中，以Fv/Fm的表達(dá)為代表的PSII 光合效率在經(jīng)褪黑素處理的植株中擁有在比未處理植株更高的數(shù)值。這些結(jié)果表明褪黑素對(duì)干旱誘導(dǎo)的光合系統(tǒng)損傷具有保護(hù)作用。此外，對(duì)氣孔導(dǎo)度，光合速率，蒸騰速率進(jìn)行測(cè)定，種子浸泡褪黑素的玉米植株顯著高于未處理的的植株，因此褪黑素可能通過提高植物的光合效率提高植物的抗旱性。

褪黑素不僅能夠促進(jìn)植物的萌發(fā)、生長(zhǎng)和繁殖，還能促進(jìn)果實(shí)的成熟［4］。褪黑素處理可以上調(diào)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)果實(shí)成熟和軟化，使番茄（Solanum lycopersicumL.）具有更好的色澤和風(fēng)味［48］。此外，Sun 等［49］蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，褪黑素處理提高了與花青素積累相關(guān)的蛋白含量。盡管對(duì)褪黑素在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的分子和代謝機(jī)制方面的研究有了很大的進(jìn)展，但對(duì)該領(lǐng)域的研究仍然面臨著很多挑戰(zhàn)，包括褪黑素的受體以及褪黑素代謝物，它們?cè)谡{(diào)節(jié)植物在逆境條件下的各種上下游信號(hào)級(jí)聯(lián)中都發(fā)揮著明顯的功能。

本研究揭示了褪黑素可能通過促進(jìn)玉米植株的生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)光合作用抗氧化作用提高植株抗非生物脅迫的能力。之前的研究大多采用根灌褪黑素或者葉面噴灑褪黑素兩種方式來提高玉米的抗生物脅迫能力［50-51］。本研究則采用浸種的方式探討干旱脅迫下外源褪黑素對(duì)玉米對(duì)抗氧化酶的影響，這些發(fā)現(xiàn)為外源性褪黑素在玉米增產(chǎn)中的潛在應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，也為深入研究褪黑素介導(dǎo)的玉米植株抵抗干旱脅迫的分子機(jī)制提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

本文主要研究了褪黑素對(duì)玉米幼苗根系發(fā)育和抗旱性的影響。首先，褪黑素促進(jìn)根系發(fā)育，與對(duì)照相比，顯著提高了主根和種子根的長(zhǎng)度，側(cè)根數(shù)量和根系總長(zhǎng)度，總表面積，促進(jìn)植物土壤水分的吸收；其次，褪黑素的施加提高了抗氧化酶（SOD，POD，CAT）的活性，強(qiáng)化了玉米抗氧化系統(tǒng)，從而可以降低干旱誘導(dǎo)的活性氧積累，幫助植物維持較高的PSII 光合效率，增強(qiáng)植物的光合作用，從而提高了植物的抗旱性。褪黑素參與了干旱條件下植物水分狀況的調(diào)節(jié)，在干旱條件下了提高玉米葉片的相對(duì)含水量。