魏菁 肖芳 宋戰(zhàn)昀│文

1 黑龍江哈爾濱海關(guān)技術(shù)中心，150028；2 吉林長(zhǎng)春海關(guān)技術(shù)中心，130062

蜜蜂病毒是威脅蜜蜂健康的最主要因素之一，通過(guò)對(duì)當(dāng)前蜜蜂患病調(diào)查，有超過(guò)25種病毒會(huì)對(duì)蜜蜂造成威脅，并進(jìn)一步感染到其他蜜蜂。其中，黑蜂王臺(tái)病毒是造成蜜蜂患病數(shù)量較多的病毒。黑蜂王臺(tái)病毒專門感染王臺(tái)內(nèi)幼蟲，當(dāng)幼蟲發(fā)病后，王臺(tái)會(huì)逐漸變黑，在蛹期死亡，形成一種與囊狀幼蟲病十分相似的堅(jiān)硬的囊。當(dāng)前黑蜂王臺(tái)病毒只在西方蜜蜂中發(fā)現(xiàn)，我國(guó)尚未見類似相關(guān)報(bào)道，但針對(duì)黑蜂王臺(tái)病毒的預(yù)防研究是十分必要的[1]。

一、黑蜂王臺(tái)病毒基因檢測(cè)

1.基于核酸序列的黑蜂王臺(tái)病毒定性

在蜜蜂體內(nèi)含有一組由基因編碼構(gòu)成的唯一性核酸序列，根據(jù)這一序列的特異性，將其作為鑒定蜜蜂是否攜帶黑蜂王臺(tái)病毒的重要指標(biāo)，以此對(duì)黑蜂王臺(tái)病毒進(jìn)行定性操作[2]。本文采用化學(xué)方法，通過(guò)人工合成的方式，將采集到的一小段蜜蜂病毒基因互補(bǔ)引物序列進(jìn)行合成，并通過(guò)定量逆轉(zhuǎn)錄的方式實(shí)施擴(kuò)增處理，并對(duì)黑蜂王臺(tái)病毒樣本中的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性檢測(cè)。首先，在進(jìn)行黑蜂王臺(tái)病毒基因編碼特異性診斷過(guò)程中，通過(guò)采用定量逆轉(zhuǎn)錄的方式，結(jié)合核酸復(fù)制所需的特殊環(huán)境，按照相應(yīng)的比例加入到定量逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需的試劑當(dāng)中，充分?jǐn)嚢韬蟮玫较鄳?yīng)的混合溶液。加之核糖核酸中DNA聚合酶作用，將黑蜂王臺(tái)病毒的核糖核酸分子作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以此合成互補(bǔ)的脫氧核糖核酸。

其次，在脫氧核糖核酸當(dāng)中找出另外一條鏈，通過(guò)脫氧核苷酸引物，完成對(duì)DNA中聚合酶的形成。在后續(xù)的每個(gè)循環(huán)當(dāng)中，逐步提高倍數(shù)，并通過(guò)PCR完成循環(huán)操作。此時(shí)，原始的核糖核酸模板逐漸被核糖核酸酶降解，只保留剩余的互補(bǔ)DNA。

最后，在定量逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成后，將得到的產(chǎn)物置于瓊脂糖凝膠中，沿相反電極方向移動(dòng)，分離得到純化的酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物。在紫外線光的照射下，利用顯微鏡對(duì)其進(jìn)行觀察，并將其與未感染黑蜂王臺(tái)病毒蜜蜂的DNA梯形條帶進(jìn)行比對(duì)，從而確定黑蜂王臺(tái)病毒基因的長(zhǎng)度。

對(duì)特異性目的基因片段進(jìn)行回收，將其用于后續(xù)質(zhì)粒的克隆以及小量制備，以此獲取到足夠數(shù)量的目的DNA片段，用于對(duì)黑蜂王臺(tái)病毒基因測(cè)序。將測(cè)序得到的核算數(shù)據(jù)輸入到相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)當(dāng)中，完成對(duì)核算序列的比對(duì)，以此完成對(duì)黑蜂王臺(tái)病毒種類的鑒定。由于定量逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的每個(gè)循環(huán)均能夠使提取樣本中的病毒拷貝數(shù)量呈指數(shù)級(jí)放大，并有更高的靈敏度，從而保證對(duì)黑蜂王臺(tái)病毒基因檢測(cè)分辨率提升。

2.qRT-PCR定量檢測(cè)

根據(jù)黑蜂王臺(tái)病毒核酸序列特異性特征，通過(guò)合成定量逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需的引物以及特異性探針，對(duì)黑蜂王臺(tái)病毒基因進(jìn)行qRT-PCR定量檢測(cè)。首先按照優(yōu)化體系，將其引入需要進(jìn)行充分反應(yīng)的實(shí)際和特異性引物當(dāng)中，再加入到黑蜂王臺(tái)病毒樣本檢測(cè)，并使用qRT-PCR儀器進(jìn)行定量。在選擇一一對(duì)應(yīng)的檢測(cè)樣本時(shí)，使用特異性探針，對(duì)其進(jìn)行同步擴(kuò)增反應(yīng)，將初始病毒含量較高的樣本剔除，保證其各個(gè)樣本之間的加樣量在同一范圍以內(nèi)[3]。通過(guò)qRT-PCR儀器對(duì)樣本進(jìn)行擴(kuò)增，得到拷貝量呈2倍速度增加的病毒，并在這一過(guò)程中通過(guò)qRTPCR儀器檢測(cè)信號(hào)功能，觀察病毒起始時(shí)的濃度值，以及達(dá)到最高峰時(shí)的檢測(cè)峰值。圖1為基于核酸序列的黑蜂王臺(tái)病毒定性結(jié)果。

圖1 黑蜂王臺(tái)病毒qRT-PCR定量檢測(cè)結(jié)果

3.蜜蜂特殊組織病毒感染程度分析

通過(guò)本文使用能與蜜蜂黑蜂王臺(tái)病毒基因序列互補(bǔ)的核算片段作為基因檢測(cè)探針，本文結(jié)合原位雜交技術(shù)可以更加清楚地通過(guò)顯微鏡觀測(cè)到蜜蜂在感染黑蜂王臺(tái)病毒后其組織中的病毒情況，對(duì)蜜蜂特殊組織病毒感染程度進(jìn)行分析。使用石蠟材料將感染黑蜂王臺(tái)病毒的蜜蜂組織器官包裹，并制成顯微鏡觀測(cè)用的玻片，并將其固定在顯微鏡的載玻片上[4]。再利用事先準(zhǔn)備的核算探針，將其與玻片上的樣本進(jìn)行反應(yīng)，將發(fā)生反應(yīng)的復(fù)合物用熒光法進(jìn)行染色。根據(jù)其熒光程度，對(duì)蜜蜂特殊組織病毒感染程度進(jìn)行推斷。當(dāng)熒光數(shù)值在0～500dB范圍以內(nèi)時(shí)，說(shuō)明蜜蜂特殊組織病毒感染程度較低；當(dāng)熒光數(shù)值在500～1500dB時(shí)，說(shuō)明蜜蜂特殊組織病毒感染程度中等；當(dāng)熒光數(shù)值在1500～2500dB時(shí)，說(shuō)明蜜蜂特殊組織病毒感染程度較高。

二、病害診斷防治方法研究

1.病害診斷

黑蜂王臺(tái)病毒的直徑通常在25～35nm之間，整體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)為無(wú)囊膜正二十面體顆粒狀，通常情況下，利用簡(jiǎn)單的觀測(cè)設(shè)備很難進(jìn)行觀測(cè)。因此，對(duì)于黑蜂王臺(tái)病毒的診斷，通常是基于蜜蜂患病癥狀、流行病學(xué)作為初步判斷依據(jù)，再通過(guò)顯微鏡觀察，得出黑蜂王臺(tái)病毒的具體病源特征。表1為黑蜂王臺(tái)病毒病原特征。

由表1可以看出，黑蜂王臺(tái)病毒主要危害蜂王的幼蟲和蛹，夏季和秋季為發(fā)病高峰期，其典型病狀為患病幼蟲無(wú)法及時(shí)脫皮并化蛹，蛻皮液逐漸累積在舊表皮當(dāng)中，使得表皮逐漸變硬，并形成囊袋狀結(jié)構(gòu)。在這一過(guò)程中，幼蟲的體色會(huì)逐漸由乳白色轉(zhuǎn)變?yōu)闇\黃色并進(jìn)一步加深，直到變成黑色，并干枯。通常情況下，黑蜂王臺(tái)病毒為無(wú)病癥隱性感染方式長(zhǎng)期存在于被感染的幼蟲當(dāng)中。除此之外，當(dāng)蜜蜂感染黑蜂王臺(tái)病毒后，神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)逐漸受到損傷，迷失方向，記憶功能與學(xué)習(xí)能力也會(huì)逐漸退化。具體表現(xiàn)為采蜜能力下降或喪失，全身抽搐，無(wú)法正常飛行。黑蜂王臺(tái)病毒的主要傳播方式為通過(guò)蜜蜂口器互飼的行為傳播，當(dāng)黑蜂王臺(tái)病毒與其他病毒共同存在時(shí)，會(huì)產(chǎn)生聯(lián)合危害，并表現(xiàn)出極強(qiáng)的致病能力。

表1 黑蜂王臺(tái)病毒病原特征

2.病害防治

通常情況下，受到黑蜂王臺(tái)病毒感染的蜜蜂當(dāng)發(fā)現(xiàn)感染時(shí)已經(jīng)說(shuō)明蜜蜂體內(nèi)黑蜂王臺(tái)病毒已經(jīng)達(dá)到一定數(shù)量，各組織器官也已經(jīng)受到了嚴(yán)重的損傷。因此，根據(jù)黑蜂王臺(tái)病毒檢測(cè)結(jié)果、病原、傳播途徑等特征進(jìn)行分析，得出針對(duì)其病害防治措施主要包括兩種：一種為物理防治措施，另一種為藥物防治措施。其中物理防治措施主要針對(duì)蜂農(nóng)而言，在蜜蜂養(yǎng)殖過(guò)程中通過(guò)對(duì)蜂場(chǎng)、蜂具以及飼料的衛(wèi)生清潔和消毒，預(yù)防黑蜂王臺(tái)病毒的產(chǎn)生，還可以通過(guò)選育抗黑蜂王臺(tái)病毒蜂種進(jìn)行預(yù)防。藥物防治措施可通過(guò)使用抗病毒藥物或中草藥喂食蜜蜂的方式預(yù)防。在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，藥物防治產(chǎn)生的藥物殘留會(huì)對(duì)蜜蜂健康及蜂產(chǎn)品造成不同程度污染。應(yīng)根據(jù)具體情況選擇對(duì)應(yīng)的防治措施，從而將損失降到最低。

除此之外，還可采用RNA干擾技術(shù)對(duì)黑蜂王臺(tái)病毒進(jìn)行防治，根據(jù)本文論述可知，通過(guò)檢測(cè)的方式可對(duì)該病毒的基因進(jìn)行定量和定性，通過(guò)RNA干擾技術(shù)對(duì)病毒進(jìn)行針對(duì)性的沉默或下調(diào)某個(gè)基因結(jié)構(gòu)的方式，降低病毒的表達(dá)水平，從分子結(jié)構(gòu)上，削弱或消除黑蜂王臺(tái)病毒的增殖能力。

三、結(jié)束語(yǔ)

當(dāng)前，生物技術(shù)正處于高速發(fā)展的時(shí)期，生物檢測(cè)技術(shù)與分析工具得到了不斷地完善和創(chuàng)新，這些技術(shù)涉及到對(duì)生物蛋白質(zhì)組、代謝產(chǎn)物、轉(zhuǎn)錄組等分析，同時(shí)也涉及到對(duì)海量生物數(shù)據(jù)的分析與處理。盡管當(dāng)前大部分的生物技術(shù)價(jià)格高昂，在一定程度上限制了新技術(shù)的應(yīng)用與推廣，但它是一種功能強(qiáng)大、效率極高的生物手段。本文通過(guò)對(duì)黑蜂王臺(tái)病毒基因檢測(cè)及其病害診斷防治方法，以威脅蜜蜂健康狀況常見的病毒為例，結(jié)合定量逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)可以有效實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的定性和定量，以此為蜜蜂養(yǎng)殖及蜂產(chǎn)品生產(chǎn)質(zhì)量和安全提供保障。