劉 暢，聶承冬，鄧 斌，李文娣，劉博男，侯冰喬，王淇漩，李文蘭*，溫 靜*

(1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076；2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥物工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150076)

卷柏為卷柏科卷柏屬植物Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring，主要功效為活血通經(jīng)[1].卷柏在《神農(nóng)本草經(jīng)》中首次記載為為活血化瘀類藥物[2].研究發(fā)現(xiàn)卷柏具有抗凝血或抑制血小板聚集的作用.在中醫(yī)范疇中，血栓即為血瘀證[3].卷柏被用作促進(jìn)血液循環(huán)的傳統(tǒng)中藥，具有較好的抗血栓活性，在中藥臨床上常用于治療血栓相關(guān)疾病，例如腦血、心肌缺血及糖尿病并發(fā)癥等[4].目前卷柏活血通經(jīng)的功效作用機(jī)制尚不明確，基于此，本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，分析卷柏活血通經(jīng)的作用機(jī)制，為卷柏的現(xiàn)代藥理學(xué)提供參考.

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件

本研究所涉及的數(shù)據(jù)庫(kù)有PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、String (https://string-db.org/cgi/input.pl)、TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、Cancer HSP(http://tcmspw.com/CancerHSP.php)、OMIM(http://www.omim.org/)、Uniprot(https://www.uniprot.org)、swisstargetprediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)和DAVID6.7 ( https://david. ncifcrf. gov/)；Cytoscape 3.7.2.

1.2 卷柏活性成分的篩選

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選活性成分，條件為“OB>30%和DL ≥0.18”.同時(shí)通過(guò)文獻(xiàn)檢索，收集補(bǔ)充卷柏活性成分進(jìn)，最終確定卷柏的主要活性成分.

1.3 卷柏活性成分活血通經(jīng)靶點(diǎn)的篩選

利用TCMSP，CancerHSP和PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取卷柏中活性成分的作用靶點(diǎn).4-Hydroxy Mephenytion，8-Demethyl Farrerol，selaginellin A，Amentoflavone，Apigenin，Azaleatin，Caffeic Acid，selaginellin D，Demethylfuropinnarin，Dihydroresveratrol，F(xiàn)arrerol，F(xiàn)astigilinB這些成分通過(guò)SwissTargetPrediction進(jìn)行預(yù)測(cè)，再通過(guò)Uniprot進(jìn)行基因信息校正，獲得預(yù)測(cè)的卷柏成分靶點(diǎn).卷柏在活血方面研究主要用痛經(jīng)，經(jīng)閉，抗血栓，抗凝血故以“Dysmenorrhea，Amenorrhea，Anti-thrombotic，Anticoagulant”為關(guān)鍵詞，在GAD和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)搜索整理基因，從而確定卷柏痛經(jīng)、經(jīng)閉、抗血栓、抗凝血的作用靶點(diǎn).

1.4 活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將卷柏的活血通經(jīng)作用靶點(diǎn)和活性成分導(dǎo)入Cytoscape中，并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出核心網(wǎng)絡(luò)，從而得到卷柏活血通經(jīng)的主要活性成分.

1.5 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將卷柏痛經(jīng)、經(jīng)閉、抗血栓、抗凝血的靶點(diǎn)基因?qū)雜tring平臺(tái)中，獲取數(shù)據(jù)，構(gòu)建卷柏活血通經(jīng)相關(guān)疾病的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI).

1.6 核心靶點(diǎn)富集分析與可視化

通過(guò)DAVID6.7，對(duì)卷柏的靶點(diǎn)進(jìn)行GO與KEGG富集分析.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 卷柏活性成分的篩選

以O(shè)B>30%和DL ≥0.18為指標(biāo)，共得到26個(gè)卷柏的活性化合物，見(jiàn)表1～3.

表1 卷柏中的活性成分(TCMSP)

表2 通過(guò)Swiss Target Prediction預(yù)測(cè)生物利用度獲得的活性成分

表3 通過(guò)文獻(xiàn)補(bǔ)充的卷柏活性成分

2.2 收集卷柏活性成分作用靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP，Pubmed 數(shù)據(jù)庫(kù)和SwissTargetPrediction預(yù)測(cè)確認(rèn)了卷柏各個(gè)活性成分抗凝血、抗血栓、痛經(jīng)、經(jīng)閉相關(guān)靶點(diǎn)，依據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘得到凝血、血栓、痛經(jīng)、經(jīng)閉相關(guān)基因，去重后得到1243個(gè)，將凝血、血栓、痛經(jīng)、經(jīng)閉靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)映射，得到靶點(diǎn)342個(gè)，確定為卷柏抗凝血、血栓、痛經(jīng)、經(jīng)閉的靶點(diǎn)基因.

2.3 活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

卷柏活血通經(jīng)靶點(diǎn)基于以343個(gè)凝血、血栓、痛經(jīng)、經(jīng)閉靶點(diǎn)基因，建立卷柏化合物-活血通經(jīng)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(如圖1所示)，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)得到中位度數(shù)為10，在度值> 10的化合物中，有4-Hydroxy Mephenytion，8-Demethyl Farrerol，selaginellin A，Amentoflavone，Apigenin，Azaleatin，Caffeic Acid，selaginellin D，Demethylfuropinnarin，Dihydroresveratrol，F(xiàn)arrerol，F(xiàn)astigilinB，度值分別為28、28、27、26、26、26、25、25、22、19、14、13這些可能是卷柏中主要抗凝血、血栓、痛經(jīng)、經(jīng)閉的物質(zhì)基礎(chǔ).

圖1 卷柏成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

卷柏活血通經(jīng)蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)中節(jié)點(diǎn)平均度數(shù)是8，以大于2倍Degree數(shù)值即16，篩選出核心靶點(diǎn)，得到9個(gè)核心靶點(diǎn)，具體見(jiàn)表4，它們與其他蛋白相互作用更強(qiáng)些，在該網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用.

表4 核心靶點(diǎn)及拓?fù)鋮?shù)

2.5 核心靶點(diǎn)富集分析與可視化

采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)卷柏活性成分抗凝血、血栓、痛經(jīng)、經(jīng)閉靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析.GO分析結(jié)果中，細(xì)胞生物過(guò)程富集的基因數(shù)較多，說(shuō)明卷柏主要通過(guò)調(diào)節(jié)以上生物過(guò)程發(fā)揮活血通經(jīng)作用.根據(jù)Count排序，篩選出BP Bioprogress13個(gè)，CC cell components11個(gè)，MF Molicular Function10個(gè)，結(jié)果如圖2(根據(jù)Count排序，取前十)所示，Pathway10個(gè)，結(jié)果如表3所示.KEGG分析中有10條信號(hào)通路，如Proteoglycans in cancer、Estrogen signaling pathway、Bladder cancer等，對(duì)10條通路進(jìn)行可視化處理，結(jié)果如圖3所示.

圖2 卷柏活血通經(jīng)靶點(diǎn)生物過(guò)程(GO)富集分析結(jié)果

表5 卷柏活血通經(jīng)靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析結(jié)果

圖3 卷柏主要靶點(diǎn)富集通路氣泡圖

表4 KEGG通路富集分析

3 討 論

血栓性疾病是由血栓過(guò)度形成導(dǎo)致血管部分或完全堵塞引起的相關(guān)疾病.血栓分布在人體不同部位引起的腦血管、心血管及外周性血管疾病的患病率及死亡率處于上升趨勢(shì)，因此治療血栓疾病的關(guān)鍵是要預(yù)防血栓的形成[4-10].在中醫(yī)理論中，痛經(jīng)的主要原因是六大外感邪入侵造成的肝氣郁結(jié)，氣滯兼阻滯血流，進(jìn)一步形成血瘀和腫塊，經(jīng)期疼痛是由于血液停滯和滯留[11-16].活血化瘀藥主治血瘀證和血栓相關(guān)疾病等，而卷柏在中國(guó)被廣泛用作改善血液循環(huán)的藥物[17].同時(shí)《神農(nóng)本草經(jīng)》又將卷柏列為活血化瘀藥.研究發(fā)現(xiàn)，卷柏可以延長(zhǎng)小鼠的凝血時(shí)間，具有抗凝血作用[18].但卷柏活血通經(jīng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)較薄弱，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測(cè)卷柏中活血通經(jīng)分子作用機(jī)制.

在卷柏活性成分及疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中分析表明AKT1、ALB、VEGFA、EGFR、PTGS2、MMP9、KDR、ESR1和MMP2等可能是卷柏的主要靶點(diǎn)，其中AKT1在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)PPI中度值相對(duì)較大，AKT1是促炎因子，在高血壓導(dǎo)致的心肌纖維化中，可能通過(guò)促進(jìn)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化為發(fā)揮作用[19].通路富集分析結(jié)果表明卷柏活血通經(jīng)靶點(diǎn)主要集中在Proteoglycans in cancer、Pathways in cancer、Estrogen signaling pathway、Bladder cancer、VEGFsignaling pathway等通路.抗凝和促凝是兩個(gè)重要的生理過(guò)程，促凝和抗凝過(guò)程之間的平衡發(fā)生紊亂，最終可能導(dǎo)致嚴(yán)重出血或血栓形成，許多源自中藥的天然產(chǎn)物在治療出血或血栓形成方面顯示出其治療潛力，中藥卷柏具有良好的抗凝血作用，可消除血瘀，如心肌缺血和糖尿病并發(fā)癥，同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道卷柏中的穗花杉雙黃酮能通過(guò)抑制血小板聚集起到活血的作用[4,20]，但卷柏炭則具有止血的作用[18]，盡管有報(bào)道稱卷柏炒后某些黃酮類化合物減少，但沒(méi)有研究揭示具體的化合物，現(xiàn)代綜合性藥理實(shí)驗(yàn)很少進(jìn)行[20].

綜上，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測(cè)及分析卷柏活血通經(jīng)活性成分的可能作用靶點(diǎn)及通路，確認(rèn)4-Hydroxy Mephenytion，8-Demethyl Farrerol，selaginellin A，Amentoflavone，Apigenin，Azaleatin，Caffeic Acid，selaginellin D，Demethylfuropinnarin，Dihydroresveratrol，F(xiàn)arrerol，F(xiàn)astigilinB可能是卷柏活血通經(jīng)的主要活性成分，但其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究.