黎妍妍，李錫宏*，王林，馮吉，張英，尹忠春

1.湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢市硚口區(qū)寶豐路6號(hào)香溢大酒店4樓430030

2.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，武漢市東西湖區(qū)金山大道1355號(hào)430040

3.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北省恩施市施州大道119號(hào)445000

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，目前連作是我國(guó)煙草生產(chǎn)中的主要種植制度。煙草連作障礙在我國(guó)煙葉種植區(qū)普遍存在，且與根際土壤微生物區(qū)系的惡化密切相關(guān)。長(zhǎng)期連作可降低土壤微生物活性，改變土壤微生物多樣性，引起土壤中微生物選擇性富集，導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變［1-2］，造成植物-土壤-微生物形成的相互依賴的生態(tài)系統(tǒng)失衡；而根際微生態(tài)失衡又會(huì)進(jìn)一步引起土壤環(huán)境惡化和病原菌的大量繁殖，使連作障礙加劇。近年來(lái)，通過(guò)生物熏蒸來(lái)緩解連作障礙已成為研究熱點(diǎn)之一。蕓薹屬植物、綠肥等常被用作生物熏蒸材料［3-4］。Lazzeri等［5］、Seigies等［6］和趙衛(wèi)松等［7］將蕓薹屬植物殘?bào)w加入土壤中，發(fā)現(xiàn)土壤微生物群落得到明顯改善，有益微生物的相對(duì)豐度增加；沈桂花［8］研究表明，采用黑麥草、油菜和紫云英等進(jìn)行生物熏蒸可提高植煙土壤微生物代謝活性；劉昕昕［9］將高硫芥菜用于熏蒸設(shè)施連作黃瓜土壤，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落多樣性顯著提高。因此，生物熏蒸通過(guò)改善根際土壤微生物區(qū)系，可有效克服連作障礙。

在菊科作物中，萬(wàn)壽菊（Tagetes erecta L.）是一種多用途的作物，具有抗菌性能［10］。煙草生產(chǎn)中，Li等［11］發(fā)現(xiàn)煙草與萬(wàn)壽菊間作具有改善土壤微生物群落的作用，土壤細(xì)菌群落的多樣性和豐富度提高，有益微生物的相對(duì)豐度增加，而土壤青枯菌的相對(duì)豐度則降低。目前，萬(wàn)壽菊秸稈也被用作生物熏蒸材料。王曉芳等［12-14］研究表明，采用萬(wàn)壽菊植物粉末或秸稈熏蒸蘋果園土壤，土壤中細(xì)菌數(shù)量增加、真菌數(shù)量減少，真菌群落多樣性、均勻度和豐富度指數(shù)均降低，可有效緩解蘋果連作障礙。然而，關(guān)于萬(wàn)壽菊秸稈熏蒸應(yīng)用于植煙土壤的研究則鮮見(jiàn)報(bào)道，對(duì)煙株根際土壤微生物群落的影響也不明確。為此，在煙田中設(shè)置施用萬(wàn)壽菊秸稈粉末、評(píng)價(jià)萬(wàn)壽菊秸稈熏蒸對(duì)植煙土壤原核微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)的影響試驗(yàn)，旨在為緩解煙草連作障礙提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

熏蒸用萬(wàn)壽菊來(lái)自上年在煙田周圍播撒的試驗(yàn)材料，采集根莖，自然風(fēng)干后，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)2 mm孔徑篩，備用。

1.2 試驗(yàn)地點(diǎn)與概況

2017—2019年，試驗(yàn)設(shè)置在湖北省恩施州宣恩縣椒園鎮(zhèn)涼風(fēng)村。試驗(yàn)地?zé)煵葸B作15年，種植煙草品種為云煙87。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 土壤主要原核微生物數(shù)量分析

1.3.1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2017年進(jìn)行萬(wàn)壽菊秸稈熏蒸用量篩選試驗(yàn)。設(shè)置5個(gè)處理，CK1：不進(jìn)行萬(wàn)壽菊秸稈熏蒸；T1、T2、T3和T4均為萬(wàn)壽菊秸稈熏蒸處理，用量分別為750、1 500、2 250和3 000 kg/hm2，于煙田施肥后（4月5日）撒施于各試驗(yàn)小區(qū)，之后起壟覆膜。每處理3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，每小區(qū)共植煙64株。種植行株距為1.2 m×0.55 m，4月25日移栽。其他按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行栽培管理。

1.3.1.2 根際土壤樣品的取樣

2017年于煙苗移栽后50 d和100 d時(shí)，在T1、T2、T3、T4和CK1處理每小區(qū)中5個(gè)區(qū)域分別選擇1株煙株，按文獻(xiàn)［15］的方法采集根際土壤樣品，混合形成1個(gè)土樣，共計(jì)30個(gè)土樣，用于土壤細(xì)菌和放線菌的培養(yǎng)。

1.3.1.3 土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量的測(cè)定

采用平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)T1、T2、T3、T4和CK1處理每克土中所含細(xì)菌和放線菌的個(gè)數(shù)［16］。細(xì)菌和放線菌分別采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和高氏1號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3.2 土壤原核微生物群落結(jié)構(gòu)分析

1.3.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于2017年研究結(jié)果，選取最佳處理，于2018—2019年連續(xù)兩年（田間試驗(yàn)設(shè)置相同）開(kāi)展試驗(yàn)。設(shè)置2個(gè)處理，3次重復(fù)，共6個(gè)小區(qū)。CK2：不進(jìn)行萬(wàn)壽菊秸稈熏蒸；TE：萬(wàn)壽菊秸稈（1 500 kg/hm2）熏蒸，于煙田施肥后（4月5日）撒施于各試驗(yàn)小區(qū)，之后起壟覆膜。種植行株距為1.2 m×0.55 m，每小區(qū)種植烤煙100株，4月28日移栽。其他按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行栽培管理。

1.3.2.2 根際土壤樣品的取樣

2019年于煙苗移栽后50 d和100 d時(shí)，在TE和CK2處理每小區(qū)中5個(gè)區(qū)域分別選擇生長(zhǎng)基本一致的1株煙株并采集其根際土壤樣品，混合后形成1個(gè)土樣。按照取樣時(shí)期分別記作TE-50、CK2-50、TE-100和CK2-100，共計(jì)12個(gè)土樣，采集后的土樣保存于-80℃冰箱，用于土壤16S擴(kuò)增子的測(cè)序。

1.3.2.3 土壤原核微生物群落分析

（1）DNA提取及PCR擴(kuò)增。用FastDNA Spin Kit試劑盒（美國(guó)MP Biomedicals公司）提取TE和CK2處理土壤總DNA。以樣品DNA為模板，用引物515F和806R［515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCG GTAA-3′；806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3′］對(duì)16S rDNA V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)［15］的方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物檢測(cè)合格后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，在Illumina Hiseq PE250測(cè)序平臺(tái)上由諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

（2）操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU）聚類與物種注釋。對(duì)所有樣品的Effective Tags進(jìn)行聚類，將相似度≥97%的有效序列歸為1個(gè)OTU。利用QIIME軟件計(jì)算土壤微生物群落的多樣性指數(shù)（Shannon多樣性指數(shù)和Sobs、Chao1豐富度指數(shù)）。對(duì)每個(gè)OTU的代表序列進(jìn)行物種注釋，并用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析，獲得每個(gè)OUT的分類水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析法（One-way ANOVA）分析土壤主要原核微生物數(shù)量在不同處理間的差異（P＜0.05），采用T檢驗(yàn)（T-test）分析土壤原核微生物群落多樣性指數(shù)、物種相對(duì)豐度等在TE和CK2處理間的差異（P＜0.05）。根據(jù)樣品在屬水平上的物種注釋及豐度信息，根據(jù)文獻(xiàn)［15］的方法對(duì)TE和CK2的前35位菌屬的相對(duì)豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后采用HemI軟件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化值繪制Heatmap圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量分析

煙株根際土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。表1顯示，細(xì)菌和放線菌數(shù)量在各處理間存在顯著差異。煙苗移栽后50 d時(shí)，萬(wàn)壽菊秸稈熏蒸的處理土壤中細(xì)菌數(shù)量較CK1增加9.80%～98.04%，其中T2、T3和T4處理顯著高于CK1；放線菌數(shù)量較CK1增加5.11%～53.98%，其中T1和T2處理顯著高于CK1。煙苗移栽100 d時(shí)，萬(wàn)壽菊秸稈熏蒸的處理土壤中細(xì)菌數(shù)量較CK1增加10.94%～94.27%，T1、T2、T3和T4處理均顯著高于CK1；放線菌數(shù)量較CK1增加2.06%～32.99%，其中T2、T3和T4處理顯著高于CK1。表明萬(wàn)壽菊秸稈熏蒸能增加土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量，但添加量750 kg/hm2（T1）、2 250 kg/hm2（T3）和3 000 kg/hm2（T4）的效果稍劣于1 500 kg/hm2（T3）的處理。因此，本試驗(yàn)中進(jìn)一步分析了萬(wàn)壽菊秸稈添加量1 500 kg/hm2的熏蒸效果。

表1 土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量的比較①Tab.1 Amount of bacteria and actinomycetes in soil

2.2 根際土壤原核微生物群落多樣性分析

對(duì)萬(wàn)壽菊秸稈熏蒸（1 500 kg/hm2，TE）和不熏蒸（CK2）的土壤原核微生物群落（圖1）比較發(fā)現(xiàn)，煙苗移栽后50 d時(shí)，TE-50和CK2-50樣品分別得到5 648個(gè)和5 233個(gè)OTUs，其中兩者間共有的OTUs數(shù)量為4 141個(gè)；煙苗移栽后100 d時(shí)，TE-100和CK2-100樣品分別得到5 626個(gè)和5 520個(gè)OTUs，其中兩者間共有的OTUs數(shù)量為4 330個(gè)。表明萬(wàn)壽菊秸稈熏蒸（TE）后土壤原核微生物群落OTUs數(shù)量明顯增多。

由表2可以看出，煙苗移栽后50 d時(shí)，TE-50土壤Sobs、Shannon和Chao 1指數(shù)均顯著高于CK2-50，較CK2-50分別增加11.81%、6.09%和11.27%。煙苗移栽后100 d時(shí)，TE-100土壤Sobs、Shannon和Chao 1指 數(shù) 較CK2-100分 別 增 加3.18%、0.21%和3.28%。表明萬(wàn)壽菊秸稈熏蒸可提高土壤原核微生物群落的多樣性和豐富度。

圖1 各組樣本OTUs分布Venn圖Fig.1 Venn diagram of OTUs distribution for each soil sample

表2 土壤原核微生物群落多樣性和豐富度分析①Tab.2 Diversity and richness indexes of prokaryotic microbial community in soil

2.3 土壤原核微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 土壤原核微生物在門水平上的組成

在門水平上，對(duì)相對(duì)豐度排名前10位的土壤原核微生物進(jìn)行了分析，結(jié)果見(jiàn)表3。不同時(shí)期檢測(cè)出TE和CK2土壤樣品中優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐度從高到低依次為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、浮霉菌門（Planctomycetes）和硝化螺旋菌門（Nitrospirae）。煙苗移栽50 d時(shí)，TE-50土壤中芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的相對(duì)豐度顯著高于CK2，其他9個(gè)菌門在兩處理間差異不顯著。煙苗移栽后100 d時(shí)，TE-100土壤中變形菌門（Proteobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的相對(duì)豐度均顯著高于CK2，其他8個(gè)菌門在兩處理間差異不顯著。

表3 門水平上土壤原核微生物的相對(duì)豐度分析Tab.3 Relative abundances of main soil prokaryotic microbes at phylum level （%）

2.3.2 土壤原核微生物在屬水平上的組成

在屬水平上，土壤中相對(duì)豐度＞1%的土壤原核微生物分析結(jié)果見(jiàn)表4。表4表明，煙苗移栽后50 d時(shí)，TE-50和CK2-50土壤中分別有8個(gè)和5個(gè)菌屬的相對(duì)豐度高于1%；TE-50中水恒桿菌屬（Mizugakiibacter）、羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）的相對(duì)豐度顯著低于CK2-50，而鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、未確定屬的芽單胞菌科（unidentified Gemmatimonadaceae）［17］和H16的相對(duì)豐度顯著高于CK2-50。煙苗移栽后100 d時(shí)，TE-100和CK2-100處理土壤中分別有11個(gè)和6個(gè)菌屬的相對(duì)豐度高于1%；TE-100處理中水恒桿菌屬（Mizugakiibacter）、未確定屬的芽單胞菌科（unidentified Gemmatimonadaceae）、伯克霍爾德菌屬（Burkholderia-Paraburkholderia）和Candidatus Solibacter的相對(duì)豐度顯著高于CK2-100，而Candidatus Nitrosotalea的相對(duì)豐度顯著低于CK2-100。

對(duì)35個(gè)菌屬相對(duì)豐度的相似性進(jìn)行HEMI聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3表明，煙苗移栽后50 d時(shí)，TE-50中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、苯基桿菌屬（Phenylobacterium）、變桿菌屬（Variibacter）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、假雙頭斧形菌屬（Pseudolabrys）、未確定屬的芽單胞菌科（unidentified Gemmatimonadaceae）、未確定屬

的硝化螺旋菌科（unidentified Nitrospiraceae）［18］、Ramlibacter、赭黃嗜鹽囊菌屬（Haliangium）、溶桿菌屬（Lysobacter）、H16和Gaiella的相對(duì)豐度較高；CK2-50中水恒桿菌屬（Mizugakiibacter）、羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、堆囊菌屬（Sorangium）、戴氏菌屬（Dyella）、不動(dòng)桿菌屬（Acidibacter）、未確定屬的酸桿菌科［unidentified Acidobacteriaceae（Subgroup 1）］［19］、Granulicella和慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）的相對(duì)豐度較高。煙苗移栽100 d時(shí)，TE-100中RB41、根微菌屬（Rhizomicrobium）、Bryobacter、Candidatus Solibacter、Reyranella、伯霍爾德桿菌屬（Burkholderia-Paraburkholderia）、紅游動(dòng)菌屬（Rhodoplanes）、黃色土源菌屬（Flavisolibacter）和酸桿菌屬（Acidobacterium）的相對(duì)豐度較高；CK2-100中Candidatus Nitrosotalea、unidentified OPB35 soil group、豐佑菌屬（Opitutus）和Aquicella的相對(duì)豐度較高。

表4 屬水平上土壤原核微生物的相對(duì)豐度分析Tab.4 Relative abundances of major soil prokaryotic microbes at genus level （%）

圖3 屬水平上原核微生物物種豐度聚類熱圖Fig.3 Heatmap of relative abundances of soil prokaryotic microbes at genus level

3 討論

本研究中發(fā)現(xiàn)，不同用量萬(wàn)壽菊秸稈熏蒸后植煙土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量均有所增加，這與其應(yīng)用于連作蘋果土壤上的研究結(jié)果一致［14］。在4種用量中，萬(wàn)壽菊秸稈1 500 kg/hm2的添加量在增加土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量中的作用最為顯著，低添加量（750 kg/hm2）的熏蒸效果不理想可能是由于添加量不足所造成的；高添加量（2 250 kg/hm2和3 000 kg/hm2）則可能會(huì)由于植物材料過(guò)多而沒(méi)有充分腐解，導(dǎo)致土壤透氣性不良、土壤顆粒黏結(jié)［14］，進(jìn)而刺激病原菌的生長(zhǎng)［20］。

土壤微生物多樣性是表征土壤穩(wěn)定性與質(zhì)量的重要指標(biāo)。微生物群落多樣性和豐富度指數(shù)越高，群落結(jié)構(gòu)越趨于穩(wěn)定［21］。煙草連作5年后，土壤微生物群落的多樣性顯著降低，逐漸趨于單一化［22］。本研究結(jié)果表明，萬(wàn)壽菊秸稈（1 500 kg/hm2）熏蒸提高了土壤原核微生物群落尤其是煙苗移栽后50 d時(shí)的土壤原核微生物群落Sobs、Shannon和Chao1指數(shù)，這與水稻秸稈還田、油菜綠肥翻壓等提高煙草根際微生物群落多樣性的作用相似［23］，有利于避免微生物種群趨于單一化，提高土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

萬(wàn)壽菊秸稈（1 500 kg/hm2）熏蒸可顯著提高土壤中芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的相對(duì)豐度，有利于更好地抑制土傳病原菌的定殖，促進(jìn)植物的健康生長(zhǎng)［15，24-25］。屬水平上的土壤原核微生物群落構(gòu)成在萬(wàn)壽菊秸稈（1 500 kg/hm2）熏蒸后也發(fā)生了變化，煙苗移栽后50 d時(shí)土壤中拮抗 菌（Sphingomonas、Pseudomonas、Gemmatimonas、unidentified Gemmatimonadaceae、Lysobacter）以及降解菌（Ramlibacter）的相對(duì)豐度明顯提高，這些原核微生物有利于抑制土傳病原菌對(duì)煙草生長(zhǎng)的危害［26-30］，降解土壤中多環(huán)芳烴物質(zhì)，減輕化感自毒物質(zhì)對(duì)根系的損傷［31］；煙苗移栽后100 d時(shí)土壤中拮抗菌（Burkholderia）、功能菌（Candidatus Solibacter、Bryobacter和Rhizomicrobium）、根際促生菌（Flavisolibacter）相對(duì)豐度也較高，這些原核微生物有利于抑制土傳病原菌，同時(shí)可分解土壤有機(jī)質(zhì)、促進(jìn)土壤碳循環(huán)，為煙株生長(zhǎng)提供足夠的營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)煙株根系發(fā)育［32-34］。萬(wàn)壽菊秸稈熏蒸提高根際土壤中這些有益菌相對(duì)豐度的原因可能是萬(wàn)壽菊秸稈中含有豐富的纖維素和木質(zhì)素［35］，可為土壤微生物的活動(dòng)提供豐富的碳源和氮源，促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)和繁殖，從而改善土壤微生物結(jié)構(gòu)［36］。

本研究中將萬(wàn)壽菊秸稈粉碎，分析并證實(shí)了萬(wàn)壽菊秸稈熏蒸在改善植煙土壤原核微生物群落結(jié)構(gòu)中的作用，而有關(guān)萬(wàn)壽菊秸稈的其他利用方式是否也具有同樣的作用效果還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

萬(wàn)壽菊秸稈熏蒸（750～3 000 kg/hm2）可增加煙株根際土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量，以1 500 kg/hm2的用量效果最明顯。萬(wàn)壽菊秸稈熏蒸（1 500 kg/hm2）可提高根際土壤原核微生物群落Shannon多樣性指數(shù)和Sobs、Chao1豐富度指數(shù)，增加拮抗菌、降解菌、功能菌和根際促生菌的相對(duì)豐度，在改善連作煙田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)中具有積極作用，同時(shí)具有緩解煙草連作障礙的潛在作用。