黃宇，汪漢成，陳乾麗，陳興江，向立剛，李忠，謝紅煉

1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽市花溪區(qū)550025

2.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽市觀山湖區(qū)龍灘壩路29號(hào)550081

3.長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北省荊州市荊秘路88號(hào)434025

4.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北省荊州市荊秘路88號(hào)434025

由高氏白粉菌（Golovinomyces cichoracearum DC）引起的煙草白粉?。═obacco powdery mildew）是煙草生產(chǎn)中常見的氣傳真菌性病害［1-3］。通常病原菌先侵染下部葉片，并逐步向上發(fā)展，發(fā)病初期呈近圓形的白色霉斑，隨后病斑逐步擴(kuò)展至整個(gè)葉片，嚴(yán)重時(shí)葉片正反兩面均覆蓋白色粉狀霉層，導(dǎo)致葉組織變黃、枯死［2］，最終失去烘烤價(jià)值，造成煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)損失高達(dá)80%［4-5］。在條件適宜的情況下，煙葉從零星出現(xiàn)病斑至全部覆蓋粉狀霉層，只需短短幾天時(shí)間，該過程還會(huì)引起煙葉葉際真菌群落結(jié)構(gòu)的變化［2］。因此，研究不同發(fā)病等級(jí)白粉病煙葉真菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)于指導(dǎo)煙草白粉病的防治具有重要意義。然而白粉病菌作為不可培養(yǎng)的真菌之一，傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法無法適用于白粉病等不可培養(yǎng)微生物的相關(guān)研究，而自然界中可培養(yǎng)微生物只占總體微生物的1%左右，因此傳統(tǒng)微生物多樣性的研究方法存在一定的局限性［6］。高通量測(cè)序技術(shù)無需對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行微生物分離培養(yǎng)，可直接從環(huán)境中提取微生物遺傳物質(zhì)，因此可以檢測(cè)環(huán)境中所有可培養(yǎng)與不可培養(yǎng)的微生物，目前已被越來越多的研究者應(yīng)用于包括腸道［7］、水體［8］、土壤［9］、植物根際［10］和葉際［11］等微生態(tài)環(huán)境的研究中。

隨著人們對(duì)于葉際微生物關(guān)注度的增加，關(guān)于植物葉際微生物的研究也越來越多［12-15］。近年來，有關(guān)植物白粉病葉際微生物的研究已有一些報(bào)道，Zhang等［11］研究表明，健康黃楊葉際真菌和細(xì)菌多樣性高于感染白粉病的黃楊；Suda等［16］分析感染黃瓜白粉病的葉際細(xì)菌群落組成發(fā)現(xiàn)，黃瓜葉片感染白粉病后其細(xì)菌數(shù)量、多樣性和豐富度均增加；Zhang等［12］和羅路云等［15］對(duì)感染南瓜白粉病的葉際微生物群落組成的試驗(yàn)表明，南瓜白粉病嚴(yán)重程度越高，其微生物群落物種豐富度越低。對(duì)于煙草白粉病除本項(xiàng)目組前期對(duì)于感染白粉病葉片的真菌群落結(jié)構(gòu)有研究報(bào)道外［17］，鮮見其他相關(guān)報(bào)道。為此，采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)感染白粉病煙株的典型病級(jí)煙葉（3級(jí)病級(jí)煙葉與9級(jí)病級(jí)煙葉）葉際真菌種群結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行分析，旨在為有效防治煙草白粉病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)于2016年在貴州省福泉市煙草基地進(jìn)行，在煙草白粉病發(fā)生嚴(yán)重的煙田（種植品種K326）采集樣品，隨機(jī)選取明顯感染白粉病煙株，剪刀經(jīng)消毒后分別剪取每株煙病情較輕的3級(jí)病級(jí)葉片和病情較為嚴(yán)重的9級(jí)病級(jí)葉片（參照國標(biāo)GB/T 23222—2008［18］），見圖1。3級(jí)病級(jí)煙葉（BFn）樣品編號(hào)分別為BFn1、BFn2和BFn3，9級(jí)病級(jí)煙葉（BFl）樣品編號(hào)分別為BFl1、BFl2和BFl3。將采集的樣品存放入低溫箱中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室并置于超低溫冰箱中保存，用于后續(xù)DNA提取。

圖1 不同病級(jí)白粉病煙葉樣品（a.9級(jí)；b.3級(jí)）Fig.1 Tobacco leaf samples infected by powdery mildew with different disease severities（a.Grade 9；b.Grade 3）

1.2 試劑與儀器

DNA提 取 試 劑 盒FastDNA?Spin kit for Soil（美國MP Biomedicals公司）；超微量核酸定量光譜儀NanoDrop 2000（美國Thermo Fisher Scientific公司）；GeneJET膠回收試劑盒（美國Thermofisher公司）；PL303稱量天平（感量0.001 g，瑞士Mettler Toledo公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品DNA提取

參照總DNA提取試劑盒（FastDNA?Spin kit for Soil）說明書進(jìn)行煙葉樣品微生物基因組總DNA的提取。DNA提取完成后，參照劉暢等［19］的方法檢測(cè)DNA的濃度和純度。

1.3.2 擴(kuò)增與測(cè)序

以提取樣品的DNA為模板，采用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對(duì) 樣 品 的ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為50μL，包括正反向引物各2μL，DNA模板2μL，ddH2O 19 μL，SYBR ? Premix Ex Taq?Ⅱ25μL，PCR反應(yīng)程序的設(shè)置及PCR產(chǎn)物純化參照陳乾麗等［20］的方法進(jìn)行。參照黃宇等［17］的方法將合格的純化樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)經(jīng)處理后，參照劉暢等［19，21］的方法對(duì)序列進(jìn)行操作分類單元（OTU）聚類和物種注釋分析，并對(duì)樣品的Alpha多樣性和物種組成進(jìn)行評(píng)估。Alpha多樣性分析可反映微生物群落的豐富度與多樣性［10］，采用軟件mothur（version v.1.30.1）計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)。通常Sobs、Ace和Chao1指數(shù)反映樣本真菌群落豐富度，指數(shù)值越大豐富度越高。Sobs指數(shù)為實(shí)際觀測(cè)到的OTUs數(shù)；Ace指數(shù)用來估計(jì)樣本群落中的OTUs數(shù)目；Chao1指數(shù)是利用Chao1算法估計(jì)樣本中OTUs數(shù)目的指數(shù)［22-23］。反映樣本真菌群落多樣性指數(shù)有Shannon和Simpson指數(shù)，Shannon指數(shù)值越大，則群落多樣性越高；而Simpson指數(shù)值越大，則群落多樣性越低。反映樣品覆蓋度的指數(shù)為Coverage指數(shù)，其值越高測(cè)序結(jié)果的真實(shí)性越高［20］。在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司I-Sanger生物信息云網(wǎng)站平臺(tái)（http：//www.i-sanger.com/project/index.html）上完成數(shù)據(jù)分析［17］。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

原始序列經(jīng)優(yōu)化處理后，3級(jí)病級(jí)煙葉（BFn）總序列數(shù)和總堿基數(shù)均高于9級(jí)病級(jí)煙葉（BFl），序列平均長(zhǎng)度均為282 bp，見表1。

表1 測(cè)序樣品數(shù)據(jù)質(zhì)控Tab.1 Data quality control of sequencing samples

2.2 測(cè)序深度分析

稀釋曲線（Rarefaction curve）用來檢查測(cè)序結(jié)果是否合理，測(cè)序深度是否覆蓋了試驗(yàn)樣品中的所有測(cè)序?qū)ο螅?4］。圖2中所有樣本在測(cè)序深度為20 000時(shí)趨于平緩，說明測(cè)序深度已經(jīng)足夠，測(cè)序數(shù)據(jù)量可滿足后續(xù)樣品間真菌群落結(jié)構(gòu)的比對(duì)分析需要。

圖2 稀釋曲線（OTU水平）Fig.2 Rarefaction curve（OTU level）

2.3 OTU聚類分析

從表2看出，3級(jí)病級(jí)煙葉樣品共鑒定到真菌門數(shù)量低于9級(jí)病級(jí)煙葉樣品，其他各級(jí)分類數(shù)量均高于9級(jí)病級(jí)煙葉樣品。Venn圖（圖3）分析結(jié)果表明，在屬和OTU水平上3級(jí)病級(jí)煙葉真菌種類遠(yuǎn)高于9級(jí)病級(jí)煙葉。BFn和BFl兩組樣品間共有的真菌屬主要為高氏白粉菌屬（Golovinomyces）、鐮刀菌屬（Fusarium）、毛殼霉屬（Chaetomium）、鏈格孢屬（Alternaria）、曲霉屬（Aspergillus）等14個(gè)；BFn獨(dú)有的真菌屬為平臍蠕孢屬（Bipolaris）、漆斑菌屬（Myrothecium）、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）、赤霉屬（Gibberella）、紅酵母屬（Rhodotorula）等31個(gè)；BFl獨(dú)有的真菌屬為木霉屬（Trichoderma、Periconia）、炭疽菌屬（Colletotrichum）、根霉屬（Rhizopus）等6個(gè)。

表2 不同病級(jí)白粉病煙葉真菌數(shù)量比較Tab.2 Total amounts of fungi in tobacco leaves infected by powdery mildew with different disease severities（個(gè)）

2.4 真菌多樣性指數(shù)分析

如表3所示，所有樣品的覆蓋度指數(shù)（Coverage index）均在0.99以上，表明測(cè)序結(jié)果合理。3級(jí)病級(jí)煙葉樣品中真菌群落的Shannon和Simpson指數(shù)與9級(jí)病級(jí)煙葉的基本一致，而Sobs、Ace和Chao1指數(shù)均高于9級(jí)病級(jí)煙葉，表明3級(jí)病級(jí)白粉病煙葉真菌群落多樣性與9級(jí)病級(jí)煙葉相近，而真菌群落豐富度高于9級(jí)病級(jí)煙葉，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 不同病級(jí)白粉病煙葉真菌群落Venn圖（a.屬水平；b.OTU水平）Fig.3 Venn diagram of fungal communities in tobacco leaves infected by powdery mildew with different disease severities（a.genus level;b.OTU level）

表3 不同病級(jí)白粉病煙葉真菌群落Alpha多樣性指數(shù)①Tab.3 Alpha diversity indexes of fungal community in tobacco leaves infected by powdery mildew with different disease severities

2.5 真菌群落組成與結(jié)構(gòu)分析

在門水平上，3級(jí)病級(jí)煙葉（BFn）的主要菌門為子囊菌門（Ascomycota，99.76%）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota，0.15%）；9級(jí)病級(jí)煙葉（BFl）的主要菌門為子囊菌門（Ascomycota，99.99%）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota，＜0.01%）。在屬水平上，3級(jí)病級(jí)煙葉（BFn）的主要菌屬為高氏白粉菌屬、曲霉屬和鏈格孢屬，相對(duì)豐度分別為99.47%、0.16%和0.08%；9級(jí)病級(jí)煙葉（BFl）的主要菌屬為高氏白粉菌屬、曲霉屬和鏈格孢屬，相對(duì)豐度分別為99.43%、0.54%和0.01%，見圖4。在3級(jí)病級(jí)煙葉和9級(jí)病級(jí)煙葉真菌群落的豐富度前15位的優(yōu)勢(shì)屬中，紅酵母屬（Rhodotorula，0.13%）、銹生殼屬（Eudarluca，＜0.01%）和枝頂孢屬（Acremonium，＜0.01%）為3級(jí)病級(jí)煙葉中獨(dú)有的屬，青霉屬（Penicillum，＜0.01%）和未分類的小戴衛(wèi)霉科真菌（Unclassified-f-Davidiellaceae，＜0.01%）為9級(jí)病級(jí)煙葉中獨(dú)有的屬，見表4。

圖4 不同病級(jí)白粉病煙葉在屬水平上的相對(duì)豐度比較Fig.4 Relative abundances of tobacco leaves infected by powdery mildew with different disease severities at genus level

表4 不同病級(jí)煙葉葉際真菌菌屬相對(duì)豐度比較Tab.4 Relative abundances of fungal genera in tobacco leaves with different disease severities （%）

3 討論

植物葉片是微生物棲息的重要場(chǎng)所，葉際微生物在幫助寄主對(duì)抗病原體方面起著至關(guān)重要的作用［11］。本研究中3級(jí)病級(jí)白粉病煙葉樣品真菌群落豐富度高于9級(jí)病級(jí)白粉病煙葉樣品，與Zhang等［12］分析的不同病級(jí)南瓜白粉病真菌群落和Manching等［25］分析的不同嚴(yán)重度玉米葉斑病細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的試驗(yàn)結(jié)果一致，3級(jí)病級(jí)煙葉和9級(jí)病級(jí)煙葉的真菌群落多樣性無明顯差異，且二者真菌群落多樣性均較低，其原因可能是由于白粉菌是專性寄生菌［26］，其吸取寄主營養(yǎng)物質(zhì)能力較強(qiáng)，當(dāng)白粉病菌侵染煙葉時(shí)，少有其他腐生真菌定殖，導(dǎo)致真菌群落多樣性較低。

3級(jí)病級(jí)煙葉與9級(jí)病級(jí)煙葉中均存在鏈格孢屬和曲霉屬。前人在煙草內(nèi)生真菌種群多樣性的研究中也發(fā)現(xiàn)鏈格孢屬和曲霉屬為煙草的內(nèi)生真菌［27］，因此本試驗(yàn)測(cè)序結(jié)果中3級(jí)病級(jí)煙葉與9級(jí)病級(jí)煙葉樣品中鏈格孢屬和曲霉屬的相對(duì)豐度較高。鏈格孢屬在白粉病煙株9級(jí)病級(jí)煙葉和3級(jí)病級(jí)煙葉的相對(duì)豐度分別為0.01%和0.08%；曲霉屬在9級(jí)病級(jí)煙葉和3級(jí)病級(jí)煙葉的相對(duì)豐度分別為0.54%和0.16%；在前期研究白粉病煙株健康煙葉（0級(jí)）中發(fā)現(xiàn)鏈格孢屬和曲霉屬的相對(duì)豐度分別為0.31%和0.34%［17］。隨著煙草白粉病病害嚴(yán)重度的增加，鏈格孢屬的相對(duì)豐度逐漸降低，推測(cè)白粉病在與鏈格孢屬真菌共生時(shí)具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，同時(shí)鏈格孢菌（Alternaria alternata）會(huì)引起煙草赤星病的發(fā)生［28］，推測(cè)煙草白粉病的發(fā)生會(huì)抑制赤星病的發(fā)展。由于白粉菌的寄生性較強(qiáng)，在煙葉白粉病發(fā)展過程中可能抑制曲霉屬真菌的生長(zhǎng)繁殖，且曲霉屬真菌具有腐生生活習(xí)性［29］，當(dāng)病害發(fā)生較嚴(yán)重時(shí)可能有利于曲霉屬真菌的生長(zhǎng)繁殖，所以隨著病害嚴(yán)重度的增加，曲霉屬的相對(duì)豐度呈先降低后增加的趨勢(shì)，但仍有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。在前期研究白粉病煙株7級(jí)發(fā)病煙葉時(shí)發(fā)現(xiàn)，曲霉屬和紅酵母屬的相對(duì)豐度分別為0.33%和0.09%［17］，隨著煙草白粉病病害嚴(yán)重度的增加（3～9級(jí)），曲霉屬的相對(duì)豐度逐漸增加，紅酵母屬的相對(duì)豐度逐漸降低。前人在烤后不同霉變程度煙葉葉際真菌群落組成研究中也發(fā)現(xiàn)煙葉霉變程度與曲霉屬真菌含量呈正相關(guān)，與紅酵母屬真菌含量呈負(fù)相關(guān)［20］，推測(cè)隨著煙草白粉病嚴(yán)重度的增加其霉變程度也會(huì)提高。

本研究中利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)白粉病煙株典型病級(jí)煙葉樣品進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)合前期對(duì)白粉病煙株的健康煙葉（病級(jí)0級(jí)）葉際真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析發(fā)現(xiàn)，不同病害嚴(yán)重度煙葉的微生物群落結(jié)構(gòu)存在一定差異，但前期僅對(duì)白粉病煙株的0級(jí)病級(jí)、3級(jí)病級(jí)、7級(jí)和9級(jí)病級(jí)煙葉葉際真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行分析，未能體現(xiàn)葉際微生物群落結(jié)構(gòu)隨病情等級(jí)變化而變化的規(guī)律，因此有關(guān)不同病情等級(jí)（病級(jí)0級(jí)、3級(jí)、5級(jí)、7級(jí)、9級(jí)）白粉病煙葉樣品的葉際真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性還有待進(jìn)一步試驗(yàn)。

4 結(jié)論

感染白粉病煙株病情較輕的3級(jí)病級(jí)煙葉葉際真菌的主要菌屬為高氏白粉菌屬（Golovinomyces，99.47%）、曲 霉 屬（Aspergillus，0.16%）、紅酵母屬（Rhodotorula，0.13%）、鏈格孢屬（Alternaria，0.08%）；感染白粉病煙株病情較嚴(yán)重的9級(jí)病級(jí)煙葉葉際真菌的主要菌屬為高氏白粉菌屬（Golovinomyces，99.43%）、曲霉屬（Aspergillus，0.54%）、鏈格孢屬（Alternaria，0.01%）。白粉病煙株的3級(jí)病級(jí)煙葉與9級(jí)病級(jí)煙葉的真菌群落結(jié)構(gòu)組成基本相似；3級(jí)病級(jí)白粉病煙葉樣品真菌群落豐富度高于9級(jí)病級(jí)白粉病煙葉樣品，但無顯著差異（P＞0.05）；3級(jí)病級(jí)白粉病煙葉真菌群落多樣性與9級(jí)病級(jí)煙葉基本相似。