張?jiān)婅?，宋佳穎 ，梁貞 ，多吉卓瑪 ，央拉 ，巴桑卓瑪 ，3

1.西藏大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，西藏拉薩850000；2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200000；3.中國藏學(xué)研究所（珠峰研究院），西藏拉薩850000

進(jìn)行基因組學(xué)的研究，需獲取高純度的基因大分子［1-3］，而高原地區(qū)由于壓力等因素，使得提取試劑受到一定的影響，從而導(dǎo)致提取DNA 的濃度、純度大幅下降，且DNA 溶液中各種物質(zhì)的污染較為嚴(yán)重，原因主要是提取方法、試劑劑量以及溶液配制等方面。通常提取DNA 的方法應(yīng)經(jīng)濟(jì)有效，可適用于-20 ℃以下冷凍的血液樣本，同時(shí)保證DNA 質(zhì)量［4］。研究表明，溶液沉淀法具有較高的核酸提取量，且DNA 純度較好［5］。其提取原理［6］主要在于 DNA 的析出，受高原低氣壓影響，在溫度恒定的條件下，氣體分子的自由程在低壓環(huán)境內(nèi)會(huì)增加，分子自由度增加［7］，從而導(dǎo)致碰撞概率下降。同樣，在DNA 提取液體中均不存在較強(qiáng)的成鍵離子，因此可排除液體間反作用離子阻力的影響，可近似地將液體離子看作氣體分子，同理可得液體中離子的碰撞概率會(huì)下降。當(dāng)碰撞概率下降時(shí)，DNA 分子相對(duì)不易進(jìn)行鍵合作用溶解，這會(huì)使DNA 提取純度及濃度大大下降，雜質(zhì)含量極大增加，從而影響高原地區(qū)分子生物學(xué)的自主發(fā)展。本研究采用市售人類基因組全血DNA 沉淀法提取試劑盒與本文改良方法分別各提取1 000 例人群全血樣本DNA，比較兩種方法高原地區(qū)DNA提取效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 血液基因組DNA 提取試劑盒（沉淀型）DP318 為市售產(chǎn)品；分光光度計(jì)（Thermo-NANODROP 2000）購自美國Thermo 公司；無水乙醇和異丙醇均為分析純。

1.2 DNA 純度判斷標(biāo)準(zhǔn) 1.6 < A260／A280< 2.0，超過此范圍表明溶液中存在RNA 污染，而低于此范圍表明溶液中存在蛋白質(zhì)、酚類等污染；A260／ A230＞1.6，以排除溶液中存在污染物，如碳水化合物、鹽類、多肽等。

1.3 試劑盒方法（以 1 000 μL 血液為例） 向 1 000 μL 抗凝血液（-40 ℃凍存1 年以上）中加入2 000 μL 細(xì)胞裂解液CL，顛倒混勻 5 次，13 400 × g 離心 1 min；棄上清，沉淀中加入500 μL 緩沖液 FG 與 5 μL Proteinase K 的混合液，立即渦旋混勻至溶液無團(tuán)塊，65 ℃水浴10 min，其間顛倒混勻數(shù)次；加入500 μL 異丙醇，顛倒充分混勻至出現(xiàn)絲狀或簇狀基因組DNA，13 400 × g 離心 5 min；棄上清，沉淀中加入 150 μL 70%乙醇，渦旋振蕩 5 s，13 400 × g 離心 2 min；棄上清，重復(fù)加入 150 μL 70%乙醇，渦旋振蕩 5 s，13 400 × g 離心 2 min；棄上清，空氣干燥DNA 沉淀直至所有液體揮發(fā)干凈（至少5 min），加入 200 μL 緩沖液 TB，低速渦旋 5 s，65 ℃加熱10 min 至1 h 溶解DNA，期間輕彈數(shù)次助溶。檢測(cè)濃度、吸光度、斷裂程度。

1.4 改良方法（以 1 000 μL 血液為例）

1.4.1 細(xì)胞裂解 試劑盒方法中進(jìn)行2 次裂解，本文改進(jìn)方法為提高細(xì)胞裂解效率，共進(jìn)行3 次裂解，共計(jì)加入CLA 溶液 2 100 ～ 3 000 μL，平均每次加入 700 ～ 1 000 μL，每次加入CLA 后均進(jìn)行振蕩操作，振蕩至圖1 碎片大小，不可過度振蕩，每次中速振蕩約20 s 即可，原方法中并未提及振蕩時(shí)間段。轉(zhuǎn)速依次為 20 096、15 072、15 072 × g。離心后去上清液的沉淀見圖1。

1.4.2 混合液溶解DNA 與蛋白質(zhì)的溶解去除 1 000 μL 樣本中可加入 FG 溶液 700 ～ 1 000 μL 和蛋白酶 K 溶液 12.5 μL，立即振蕩。加入混合液后放入恒溫水浴鍋（60 ～65 ℃）水浴40 ～ 60 min，取出。

1.4.3 DNA 析出 從水浴鍋中取出后，加入1 000 μL 4 ℃冷藏的異丙醇，緩慢上下顛倒混勻約20 次直至沉淀析出（圖2A），12 560 × g 離心 16 ～ 20 min。由于本方法 DNA 析出后較難聚合，建議離心時(shí)間增加，以避免去上清液時(shí)不慎將DNA 到出。

1.4.4 DNA 洗滌 離心后小心去除上清液［由于DNA 呈透明高密度流體狀（圖2B），較難從溶液中辨別出來，建議在燈光下去除上清液）］，加入70%冰乙醇溶液1 000 μL（考慮到高原地區(qū)乙醇易揮發(fā)的特性，為避免誤差，建議配置71% ～73%的乙醇溶液），輕微上下顛倒混勻 15 ～ 20 次，12 560 × g離心3 min；去上清，沉淀為白色透明的結(jié)晶狀物體（圖2C）。同上步驟進(jìn)行第2 次乙醇洗滌，以去除鹽離子等污染物（圖2D），倒置在潔凈的濾紙或其他紙張上15 min（圖2E），使乙醇流出后再正立放置于通風(fēng)處開蓋10 min；加入DNA溶解液（BL 溶液或超純水）。

圖1 細(xì)胞裂解過程

圖2 DNA 析出與洗滌過程

1.4.5 注意事項(xiàng) 提取DNA 過程中為避免DNA 斷裂應(yīng)盡量防止劇烈振蕩，如DNA 掉落應(yīng)使用移液槍槍頭輕輕吸起，不可反復(fù)抽吸以使DNA 斷裂概率增加。同時(shí)本方法提取DNA 的濃度較高，因此溶解時(shí)可加大TB 用量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過R 語言（RStudio-R.3.5.2）對(duì)兩種方法提取的 DNA 的濃度、吸光度（A260／ A280、A260／ A230）分布情況進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，并進(jìn)行Shapiro-Wilk、Wilcoxon-test 及T-test分析。以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，所有組別均不屬于正態(tài)分布，呈現(xiàn)離散型變量分布特征，見表1 和圖3。Shapiro-Wilk、Wilcoxontest 及T-test 分析結(jié)果顯示，兩種方法提取的DNA 濃度、A260／A280、A260／ A230差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01），見表1、圖4和圖5。表明市售沉淀法試劑盒提取標(biāo)準(zhǔn)不完全適用于高原地區(qū)DNA 的提取。

根據(jù)數(shù)據(jù)的均值［XcA= 26.5 ／ XcB= 199.5，X（A）A260／A280=1.2 ／ X（B）A260／A280= 1.8，X（A）A260／A230= 1.4 ／ X（B）A260／A230= 1.6］發(fā)現(xiàn)，本文改良方法的均值水平均遠(yuǎn)高于試劑盒的均值水平，且與標(biāo)準(zhǔn)DNA 指標(biāo)相近。同時(shí)從吸光度的標(biāo)準(zhǔn)差角度分析，本文改良方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)于試劑盒更穩(wěn)健，異常值較少，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠［如 S（A）A260／A280= 0.12 ／ S（B）A260／A280= 0.05］。因此，從均值和標(biāo)準(zhǔn)差的角度進(jìn)一步證明本文改良方法更適用于高原地區(qū)DNA 的提取。

圖3 兩種方法提取的DNA 吸光度分布情況

圖4 分析結(jié)果的散點(diǎn)圖

圖5 分析結(jié)果的箱線圖

表1 兩種方法提取的DNA 濃度、吸光度比值的3 種檢驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

據(jù)聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署（United Nations Environment Programme，UNEP）報(bào)告，世界上約 12%人口受高原環(huán)境的影響［8］。在高原地區(qū)，高原病是困擾人們的難題，分子機(jī)制的研究逐漸成為疾病治愈的重要途徑，而DNA 的提取質(zhì)量是疾病大分子機(jī)制研究的重要一環(huán)。本文改良方法與普通試劑盒比較后發(fā)現(xiàn)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），市售試劑盒的提取方法及標(biāo)準(zhǔn)不完全適用于高原地區(qū)DNA 的提取，而本文改良的方法有效增加了DNA 的提取純度及濃度。本實(shí)驗(yàn)為我國西藏地區(qū)分子生物學(xué)的發(fā)展提供了生物學(xué)技術(shù)支持。