★符小聰 張濤 賴冬萍 丁明健（.江門市五邑中醫(yī)院脾胃病科 廣東 江門 59000；.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院消化科 南寧 5000；.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 南寧 5000）

反流性食管炎（Reflux Esophagitis, RE）是一種常見的臨床慢性炎癥性疾病，其發(fā)生的主要原因是胃液中含有的胃酸、膽鹽及其他有害物質(zhì)反流進(jìn)入食管，致使食管黏膜損傷［1］。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，RE在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率高達(dá)40 %［2］，其在亞洲的患病率低于歐洲和美洲，但近年來在亞洲有明顯上升趨勢［3］。目前，臨床上通常使用質(zhì)子泵抑制劑、抗返流藥物、胃動(dòng)力藥物和抗抑郁藥物來治療RE。質(zhì)子泵抑制劑是首選藥物，其在抑制胃酸分泌和緩解RE患者疼痛方面是最有效的，但是質(zhì)子泵抑制劑不能控制RE的關(guān)鍵致病因素，也不能完全治愈RE［4］。并且，長期使用質(zhì)子泵抑制劑會導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥［5］。

現(xiàn)階段，一些中藥方已被用于治療RE，這些中藥方在緩解癥狀、提高治愈率、減少復(fù)發(fā)及不良反應(yīng)方面顯示出明顯優(yōu)勢［6］。旋覆代赭湯出自東漢張仲景《傷寒論》，由旋覆花、人參、生姜、代赭石、甘草、半夏、大棗七味中草藥組成。它對改善患者胃、食管黏膜炎癥和臨床癥狀，提高適應(yīng)病治療的有效率方面均有一定的作用［7］。此外，相關(guān)研究顯示，旋覆代赭湯無顯著毒副作用，在臨床治療RE患者中沒有引起明顯的不良反應(yīng)，但其發(fā)揮治療RE的藥理作用機(jī)制仍有待闡明。于是，本研究基于大數(shù)據(jù)庫挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，旨在探討旋覆代赭湯對RE的治療作用機(jī)制，重點(diǎn)揭示其可能作用的關(guān)鍵基因和介導(dǎo)的信號通路。本研究將有助于促進(jìn)旋覆代赭湯的臨床應(yīng)用和新藥研發(fā)。

1 方法

1.1 反流性食管炎相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 為了收集RE患者的差異表達(dá)基因（Differentially Expressed Genes，DEGs)數(shù)據(jù)，在Gene Expression Omnibus（GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）數(shù)據(jù)庫中挖掘了mRNA高通量RNA測序和微陣列圖譜。mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)采用log2算法進(jìn)行歸一化和變換，用Fold change（FC）法檢測RE患者組和正常組mRNAs的差異表達(dá)。如果｜logFC｜＞1且PValue＜0.05，則將mRNA標(biāo)記為DEGs。同時(shí)利用R語言繪制DEGs火山圖。

1.2 旋覆代赭湯有效化合物及對應(yīng)靶點(diǎn)的篩選 利用TCMSP平臺（中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺，http://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索旋覆代赭湯中旋覆花、人參、生姜、代赭石、甘草、半夏、大棗七味藥的主要化學(xué)成分，以ADME性質(zhì)［8］：口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18為依據(jù)篩選可能入血的有效成分，并進(jìn)行整理。通過DrugBank數(shù)據(jù)庫篩選出化合物對應(yīng)的靶點(diǎn)，進(jìn)行整理并刪除重復(fù)項(xiàng)。

1.3 “化合物-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 利用Perl語言獲得RE差異表達(dá)基因與旋覆代赭湯對應(yīng)靶點(diǎn)基因的交集靶點(diǎn)。將旋覆代赭湯的有效化合物與其對應(yīng)交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件（http://www.cytoscape.org/）構(gòu)建“化合物-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與功能模塊分析 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)進(jìn)行分析得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，再將蛋白互作信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件進(jìn)行可視化及蛋白相互作用分析。利用MCODE插件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類，以篩選出密集連接的功能模塊，利用Cytohubba插件篩選核心關(guān)鍵基因（Hub gene）；再分別利用David在線分析平臺和ClueGO、CluePedia插件對所篩選的功能模塊及Hub基因進(jìn)行生物學(xué)功能注釋和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。

1.5 Hub基因-KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將得到旋覆代赭湯作用于RE的主要通路與核心Hub基因文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建“Hub基因-KEGG”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 RE差異表達(dá)基因的確定 從GEO數(shù)據(jù)庫下載符合標(biāo)準(zhǔn)的GSE68698數(shù)據(jù)集，并利用R軟件包“l(fā)imma”對其進(jìn)行分析。GSE68698數(shù)據(jù)集基于GPL6480平臺獲得，包含7例正常樣本和16例RE患者樣本。根據(jù)FC分析（篩選條件｜logFC｜＞1且adj.PValue＜ 0.05）共檢測到186個(gè)DEGs，其中表達(dá)上調(diào)的基因有100個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因有86個(gè)（圖1）。

圖1 GSE68698差異表達(dá)基因火山圖

2.2 旋覆代赭湯的有效化合物收集及靶點(diǎn)預(yù)測 在TCMSP平臺以旋覆花、人參、生姜、代赭石、甘草、半夏、大棗為關(guān)鍵詞，共搜索到1037個(gè)相關(guān)化合物。根據(jù)設(shè)定的篩選條件，篩得旋覆花有效化合物19個(gè)、人參有效化合物22個(gè)、生姜有效化合物5個(gè)、甘草有效化合物92個(gè)、半夏有效化合物13個(gè)、大棗有效化合物29個(gè)，共180個(gè)化合物，去重后共得到165個(gè)有效化合物成分。應(yīng)用DrugBank數(shù)據(jù)庫收集并篩選這165個(gè)有效化合物對應(yīng)的靶點(diǎn)，整理全部靶點(diǎn)并刪除重復(fù)項(xiàng)。其中代赭石為礦物質(zhì)成分氧化鐵（Fe2O3），在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中未找到相對應(yīng)的化學(xué)成分及對應(yīng)靶點(diǎn)。

2.3 “化合物-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及拓?fù)浞治?應(yīng)用Perl語言合并獲得RE差異表達(dá)基因與旋覆代赭湯對應(yīng)靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)共71個(gè)，與交集靶點(diǎn)相互作用的有效化合物115個(gè)。將這115個(gè)有效化合物與交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建“化合物-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)（圖2）。該網(wǎng)絡(luò)圖由186個(gè)節(jié)點(diǎn)（115個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)和71個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）和576條邊組成，其中三角形代表靶點(diǎn)、橢圓形代表化合物，且紅色橢圓形化合物節(jié)點(diǎn)表示旋覆代赭湯中7味中藥的共同有效化合物。應(yīng)用Network Analysis插件進(jìn)一步進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的Degree和Betweenness Centrality大小篩選出該網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵化合物（木犀草素、槲皮素、黃芩素、β-胡蘿卜素、豆甾醇、千金藤堿、山奈酚、β-谷甾醇、人參皂苷RH2、柚皮素等）及核心 靶點(diǎn)（AKT1、JUN、EGFR、VEGFA、CCNA2、PPARG、CASP3、MAPK1、MMP1等），認(rèn)為這些化合物及靶點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起到橋梁作用。

圖2 有效化合物-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 旋覆代赭湯治療反流性食管炎作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及MCODE功能模塊分析 將71個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置置信度大于0.400，并剔除孤立的靶點(diǎn)蛋白，獲得蛋白互作信息，利用Cytoscape3.7.1軟件進(jìn)行分析，得到圖3A。該網(wǎng)絡(luò)由71個(gè)節(jié)點(diǎn)和1176邊組成，經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析可知，節(jié)點(diǎn)平均Degree為33.13，大于平均Degree的節(jié)點(diǎn)有34個(gè)；節(jié)點(diǎn)平均Betweenness Centrality為0.0080，大于平均Betweenness Centrality的節(jié)點(diǎn)有24個(gè)。為了篩選重要模塊，利用MCODE插件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類，MCODE可用于識別PPI網(wǎng)絡(luò)中最密集和最重要的功能模塊。設(shè)置篩選標(biāo)準(zhǔn)：Degree Cutoff=2、Node Score Cutoff=0.2、Max.Depth=100、以及K-Core=2，運(yùn)行后獲得最重要功能模塊（圖3C），認(rèn)為該模塊涉及的基因在PPI網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵功能調(diào)控作用。

接著使用David軟件對該最重要模塊中涉及的基因進(jìn)行功能分析，GO分析結(jié)果顯示，在血管生成、細(xì)胞增殖、凋亡、蛋白質(zhì)磷酸化、MAPK級聯(lián)反應(yīng)、缺氧和脂多糖介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程中，重要模塊基因富集顯著（圖4A）。重要模塊基因細(xì)胞成分的變化主要集中在蛋白質(zhì)復(fù)合物表面、細(xì)胞質(zhì)、胞外間隙、胞外區(qū)和細(xì)胞核中（圖4B）。重要模塊基因分子功能的變化主要集中在蛋白激酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合和泛素蛋白連接酶結(jié)合上（圖4C）。KEGG通路分析表明，重要模塊基因主要富集在癌癥途徑、癌癥蛋白多糖途徑、PI3K-Akt信號通路、灶性粘連、MAPK信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路中（圖4D）。

圖3 交集靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析及MCODE功能模塊

圖4 MCODE功能模塊基因GO及KEGG分析

2.5 旋覆代赭湯作用于RE的Hub基因選擇 利用Cytohubba插件的六種不同算法篩選Hub基因，每種算法均篩選出Top10的Hub基因，如圖5所示。將六種算法獲得的Hub基因取交集，得到最終的核心Hub基因7個(gè)： AKT1、EGFR、JUN、VEGFA、MAPK3、ALB和STAT3，并列舉了這些核心Hub基因的名稱、縮寫及功能（表1）。同時(shí)應(yīng)用ClueGO和CluePedia插件對核心Hub基因進(jìn)行生物學(xué)功能及KEGG通路注釋（圖6）。結(jié)果表明，旋覆代赭湯主要通過作用于這些核心Hub基因調(diào)控機(jī)體各種生物學(xué)過程及各種信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)以發(fā)揮防治RE的作用。

圖5 六種不同算法的Hub基因

表1 核心Hub基因的功能作用

圖6 核心Hub基因的生物學(xué)功能注釋分析和KEGG功能注釋分析

2.6 旋覆代赭湯作用于RE的Hub基因與KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)分析 將得到的旋覆代赭湯治療RE涉及的主要通路與核心Hub基因文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建“Hub基因-KEGG”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（圖7）。該網(wǎng)絡(luò)由26個(gè)節(jié)點(diǎn)（6個(gè)Hub基因節(jié)點(diǎn)和20個(gè)通路節(jié)點(diǎn)）和77條邊組成，其中三角形代表通路、圓形代表Hub基因，且節(jié)點(diǎn)形狀越大表示在該網(wǎng)絡(luò)中所占權(quán)重越大。由圖可知，AKT1、EGFR、VEGFA、JUN基因和癌癥通路（hsa05200）、癌癥中蛋白多糖通路（hsa05205）、PI3K-Akt 信號通路（hsa04151）、ErbB 信 號 通 路（hsa04012）、HIF-1信 號 通 路（hsa04066）、FoxO 信號通路（hsa04068）、黏著斑（hsa04510）、MAPK信號通路（hsa04010）、雌激素信號通路（hsa04915）在該網(wǎng)絡(luò)中起到核心調(diào)控作用。

圖7 Hub基因-KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

在中醫(yī)理論體系中，RE主要表現(xiàn)為胃酸反流、梅核氣、胸痹等。本病的病灶位于胃和食管，與肝、脾、肺、腎、膽密切相關(guān)。飲食和情緒等多種因素會導(dǎo)致脾胃功能失調(diào)，從而產(chǎn)生RE的癥狀［9-10］。旋覆代赭湯運(yùn)用中醫(yī)陰陽平衡理論辨證論治，根據(jù)中藥配伍規(guī)律，由七味中藥組成。其中，旋覆花含有黃銅類和萜類化合物，具有明顯的抗菌、抗炎、抗氧化以及促進(jìn)胃腸道蠕動(dòng)作用，能顯著緩解RE的癥狀；半夏、甘草、生姜是廣泛用于治療胃腸道疾病的中藥，具有抗炎、調(diào)節(jié)膽汁分泌和改善胃腸黏膜損傷的作用；代赭石含有鎂離子，其可在胃腸道內(nèi)形成一定的滲透壓，維持胃腸道內(nèi)的水分充足，促進(jìn)胃腸道的規(guī)律性蠕動(dòng)；大棗和人參含有小檗堿和人參皂苷RH2，對RE具有一定的治療作用［11-12］。中藥中的這些成分可單獨(dú)或協(xié)同作用以增強(qiáng)治療效果。簡而言之，旋覆代赭湯的治療效果可能歸因于上述生物活性化合物，但仍需進(jìn)一步系統(tǒng)探討。

本研究首次在大數(shù)據(jù)庫挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的基礎(chǔ)上，探索了旋覆代赭湯治療RE的潛在靶點(diǎn)。結(jié)果顯示，建立了186個(gè)節(jié)點(diǎn)、576個(gè)交互作用的藥物成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并在藥物靶點(diǎn)和RE差異表達(dá)基因之間共發(fā)現(xiàn)了71個(gè)交集靶點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了基于交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)、基于中心節(jié)點(diǎn)的功能模塊網(wǎng)絡(luò)和Hub基因的提取。這些Hub基因節(jié)點(diǎn)如AKT1、EGFR、VEGFA、JUN、STAT3和MAPK3主要 富集于癌癥通路、PI3K- AKT 信號通路、MAPK信號通路、HIF-1信號通路和雌激素信號通路等。AKT 即蛋白激酶B，是 PI3K- AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一個(gè)重要的下游因子，在各種細(xì)胞的增殖和凋亡中都是必不可少的［13］。先前的薈萃分析表明，AKT1在正常食管-反流性食管炎-Barrett 食管-異型增生-食管腺癌中異常激活，其激活水平與疾病的階段顯著相關(guān)［14］。重要的是，AKT1各種中藥的重要藥物靶點(diǎn)［15-16］。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是表皮生長因子細(xì)胞增殖及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體，是一種酪氨酸激酶激活的跨膜蛋白［17］。研究表明，EGFR在反流性食管炎的發(fā)展進(jìn)程中表達(dá)逐漸升高，且與AKT的表達(dá)密切相關(guān)。在本研究中，AKT1和EGFR不僅是旋覆代赭湯的重要靶點(diǎn)和RE相關(guān)靶點(diǎn)之間發(fā)現(xiàn)的交集靶點(diǎn)，而且是PPI模塊中的樞紐節(jié)點(diǎn)。因此，我們推測AKT1和EGFR等基因可能是旋覆代赭湯治療RE的潛在靶點(diǎn)。

相關(guān)研究認(rèn)為，細(xì)胞炎癥因子在RE的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，而炎癥因子的激活依賴于細(xì)胞內(nèi)外多條信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。已有研究證實(shí)PI3K-AKT信號通路參與體內(nèi)大多數(shù)炎癥反應(yīng)，且以往的研究也報(bào)道顯示AKT與食管的病變密切相關(guān)［18］。另外，Zhuang等人也證明PI3K-AKT信號通路的激活在反流性食管炎的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，抑制PI3K-AKT信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)科減少多種炎癥因子的釋放，從而控制RE的發(fā)展進(jìn)程［19］。Rafiee等人的研究表明PI3K-AKT和MAPK調(diào)節(jié)的Hsp70和Hsp27的誘導(dǎo)是調(diào)節(jié)人食管微血管內(nèi)皮細(xì)胞對酸性pH應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵機(jī)制［20］。此外，在反流性食管炎的食管上皮中，MAPK家族蛋白被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)節(jié)緊密連接蛋白，這些緊密連接蛋白是反流性食管炎的敏感標(biāo)志［21］。研究顯示，EGFR 在食管角化細(xì)胞中過表達(dá)介導(dǎo)了PI3K-AKT和MAPK信號通路的激活，從而促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和遷移，使得RE向腫瘤化進(jìn)展［22］。在本研究中，KEGG通路分析表明AKT1和EGFR等Hub基因主要富集在PI3K-AKT信號通路和MAPK信號通路中。因此，我們推測旋覆代赭湯治療RE的效用可能是通過靶向AKT1和EGFR等PI3K-AKT信號通路和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法清晰地闡明了旋覆代赭湯抑制炎癥反應(yīng)的多靶點(diǎn)、多組分作用特點(diǎn)。我們通過幾個(gè)數(shù)據(jù)庫確定了與旋覆代赭湯和RE相關(guān)的潛在靶點(diǎn)。然后，將兩類靶點(diǎn)合并取交集獲得交集靶點(diǎn)，再將交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI分析，從交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)中得到最重要功能模塊及核心Hub基因。最后，我們進(jìn)行了功能富集分析，以闡明旋覆代赭湯治療RE的多種機(jī)制。旋覆代赭湯治療RE的直接途徑有細(xì)胞增殖的調(diào)控、脂多糖介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK級聯(lián)反應(yīng)和PI3K-AKT信號通路信號通路等。將相關(guān)結(jié)果與RE的現(xiàn)有治療方法相結(jié)合，我們認(rèn)為旋覆代赭湯在治療RE時(shí)具有抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞增殖的作用。