孫曉輝，趙斌，劉洋，崔明星

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 衛(wèi)輝 453100)

軟骨損傷在骨科臨床較為常見，由于軟骨組織缺乏血管、神經(jīng)和淋巴系統(tǒng)，自我修復(fù)能力非常有限[1]。目前，主要采用骨軟骨移植等方法修復(fù)軟骨損傷，但存在修復(fù)后軟骨結(jié)構(gòu)差、承重能力下降及易磨損等缺點[2]。研究表明，軟骨細(xì)胞(chondrocytes，chon)與聚乳酸羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]構(gòu)建的組織工程骨軟骨復(fù)合體，可以促進軟骨細(xì)胞分泌軟骨基質(zhì)，增強對軟骨的保護作用，且在軟骨組織中具有較好的親和力[3]。因此，利用組織工程骨軟骨復(fù)合體治療軟骨缺損具有較大的潛力和優(yōu)勢。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)能夠促進組織再生，且無需誘導(dǎo)細(xì)胞分化即可直接植入[4-5]。目前，負(fù)載BMSC的骨軟骨復(fù)合體已在實驗室和臨床研究中用于軟骨修復(fù)。然而，BMSC用于軟骨修復(fù)對供體年齡有嚴(yán)格的要求，大齡供體的BMSC的增殖和分化能力均顯著下降，導(dǎo)致修復(fù)效果不佳。因此，采用負(fù)載BMSC的骨軟骨復(fù)合體進行軟骨修復(fù)并不是最佳方法[6-7]。

研究發(fā)現(xiàn)，BMSC通過旁分泌效應(yīng)發(fā)揮對軟骨的修復(fù)作用，而外泌體(exosomes,exo)在修復(fù)過程中發(fā)揮了重要作用[8]。外泌體是細(xì)胞分泌的具有單層膜結(jié)構(gòu)的囊泡，直徑50～100 nm，存在于BMSC旁分泌介質(zhì)中。研究表明，BMSC來源外泌體(BMSC-exo)具有促進心臟、肝臟、皮膚、軟骨等組織修復(fù)的作用[6]。與植入BMSC相比，植入BMSC-exo具有無細(xì)胞、易于操作、支持多途徑使用等優(yōu)勢。microRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度為18～36 bp的非編碼單鏈RNA分子，其在動植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)調(diào)控。研究表明，miRNA-27b(miR-27b)具有促進軟骨細(xì)胞增殖并加速軟骨細(xì)胞再生的作用[9-13]，但目前仍缺乏關(guān)于負(fù)載miR-27b-BMSC來源外泌體的軟骨細(xì)胞-PLGA(miR-27b-BMSC-exo-chon-PLGA)骨軟骨復(fù)合體移植治療軟骨缺損的實驗研究。為了進一步觀察負(fù)載miR-27b-BMSC-exo-chon-PLGA骨軟骨復(fù)合體移植治療軟骨缺損的效果并探究其作用機制，我們圍繞miR-27b-BMSC-exo開展了相關(guān)的實驗研究，現(xiàn)總結(jié)報告如下。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料BMSC(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)，大鼠軟骨細(xì)胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)，miR-27b過表達(dá)的重組腺病毒載體(上海吉凱基因科技有限公司)，引物由北京天根生物化學(xué)有限公司合成，PLGA(北京奧京生物科技有限公司)，Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心)。實驗方案通過新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實驗試劑醋酸雙氧乙鈾溶液(青島捷世康生物科技有限公司)，蛋白抽提試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國賽默飛公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，兔抗鼠CD9、CD63、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease，caspase)-3前體、切割-caspase-3、caspase-9前體、切割-caspase-9、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-13、β-肌動蛋白(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、Ⅱ型膠原蛋白一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G二抗、生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(美國Abcam公司)，胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β(北京同立海源生物科技有限公司)，Trizol試劑、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒、蘇木精伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色試劑盒、番紅O-固綠染色試劑盒、阿爾新藍(lán)蘇木精/橙G(Alcian Blue Hematoxylin/Orange G，ABH/OG)染色試劑盒、抗原修復(fù)液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)，TaqMan miRNA分析試劑盒(哈爾濱HaiGene公司)，Dil細(xì)胞膜紅色熒光探針(上海源葉生物科技有限公司)，Hoechst33258染色試劑(合肥Biosharp公司)，噻唑藍(lán)[生工生物工程(上海)股份有限公司]，鹽酸氯胺酮注射液(重慶藥友制藥有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字H50021106)。

1.3 實驗儀器超高速離心機(德國Herolab公司)，透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)，Mastersizer 2000激光粒度分析儀(英國馬爾文儀器有限公司)，Zeta電位分析儀(美國布魯克海文儀器公司)，D2500熒光顯微鏡(德國徠卡公司)。

2 方 法

2.1BMSC和大鼠軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)將BMSC和大鼠軟骨細(xì)胞分別培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基上，置于溫度為37 ℃、二氧化碳濃度為5%的培養(yǎng)箱中。每36 h換液1次，每72 h傳代1次。

2.2BMSC-exo的制備與鑒定

2.2.1BMSC-exo的制備 取4 mL培養(yǎng)至第2或第3代的BMSC培養(yǎng)液于15 mL離心管中，于4 ℃下以2000×g離心5 min后，轉(zhuǎn)移上清液至新的15 mL離心管。重復(fù)該步驟，依次以3500×g離心15 min、10 000×g離心30 min、120 000×g離心140 min。最后一次離心完成后，棄去上清液，用4 mL無菌PBS將沉淀重新懸浮，用0.22 μm無菌過濾器過濾，轉(zhuǎn)入5 mL離心管中，在4 ℃下以120 000×g離心70 min。離心后棄去上清液，離心管底部殘留的微量沉淀即為BMSC-exo。加入100 μL的無菌PBS懸浮，放置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2BMSC-exo的鑒定 取10 μL BMSC-exo懸液，滴入載樣銅網(wǎng)中，保留1.5 min，滴加2%醋酸雙氧乙鈾溶液染色1 min后，用濾紙吸干，再在室溫下晾1 min。將載樣銅網(wǎng)置于樣品室，使用透射電子顯微鏡觀察和拍照。取10 μL BMSC-exo懸液，注入Mastersizer 2000激光粒度分析儀，測定BMSC-exo的粒徑。取10 μL BMSC-exo懸液，加入到Zeta電位分析儀，測定BMSC-exo的Zeta電位。

2.2.3BMSC-exo表面標(biāo)記蛋白分析 分別取一定量的BMSC和BMSC-exo，使用蛋白抽提試劑盒提取總蛋白，并采用BCA法測定蛋白濃度。采用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測BMSC-exo的表面標(biāo)記蛋白CD9和CD63：取BMSC蛋白和BMSC-exo蛋白進行SDS-PAGE，每個樣品設(shè)置6個復(fù)孔，每孔加入的總蛋白量相同；將凝膠上的蛋白濕轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，加入2%牛血清白蛋白于室溫下封閉2 h，加入兔抗鼠CD9、CD63、GAPDH一抗，于4 ℃孵育過夜，抗體使用比例分別為1∶800、1∶500、1∶5000；使用TBST溶液漂洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG二抗，抗體使用比例為1∶1 000，于室溫下孵育1 h，再次用TBST溶液漂洗，根據(jù)化學(xué)發(fā)光試劑盒說明進行顯色。拍照后采用Image-J圖像處理軟件處理圖片，提取蛋白條帶的灰度值，并分別以GAPDH蛋白和BMSC為基準(zhǔn)進行2次標(biāo)準(zhǔn)化處理，計算蛋白條帶的相對灰度值，比較蛋白的相對表達(dá)水平。

2.3 感染重組腺病毒的BMSC中miR-27b的表達(dá)分析取培養(yǎng)至第2或第3代的BMSC分為2組，分別接種在2塊6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量約1×105個。待每孔細(xì)胞數(shù)量達(dá)到約2×105時，更換新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基，BMSC組加入2 mL新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基，miR-27b-BMSC組加入2 mL miR-27b過表達(dá)的重組腺病毒(感染復(fù)數(shù)為100)培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，根據(jù)2.2.1的方法分別制備BMSC-exo和miR-27b-BMSC-exo。采用Trizol法分別提取BMSC、BMSC-exo、miR-27b-BMSC、miR-27b-BMSC-exo中的總RNA；根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA；采用TaqMan MicroRNA檢測試劑盒說明進行實時定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)，使用U6作為內(nèi)參基因；計算CT值，并使用2-ΔΔCT計算miR-27b的相對表達(dá)量。miR-27b的正向引物：5′-CGTGGTGGCGTCAGAGGCGGTTTG-3′，反向引物：5′-CCGCCCAGCAGGGACAAAGAAC-3′；內(nèi)參基因U6的正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

2.4 大鼠軟骨細(xì)胞攝取miR-27-BMSC-exo的情況觀察取100 μL濃度為80 μg·mL-1的miR-27b-exo，加入1 mL Dil細(xì)胞膜紅色熒光探針，于4 ℃染色30 min；染色后于4 ℃下以10 000×g離心60 min，棄上清液；用PBS洗滌沉淀3次，每次洗滌后于4 ℃下以 10 000×g離心60 min，棄上清液；加入100 μL無菌PBS將沉淀懸浮以備用。取1 mL培養(yǎng)至第2或第3代的大鼠軟骨細(xì)胞液(細(xì)胞密度約為3×105個·mL-1)接種于放置有爬片的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合率達(dá)到80%時，加入100 μL上述miR-27b-BMSC-exo懸液，8字軌道輕輕混勻，于37 ℃下培養(yǎng)4 h。在培養(yǎng)皿中加入1 mL Hoechst33258染色液，染色5 min；吸取染色液，用PBS洗滌3次。取出爬片置于載玻片上，加蓋玻片后，置于熒光顯微鏡下觀察。

2.5 共培養(yǎng)后大鼠軟骨細(xì)胞中miR-27b的表達(dá)分析取一定量培養(yǎng)至第2或第3代的大鼠軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，分為2組。BMSC-exo組接種于BMSC-exo終濃度為80 μg·mL-1的RPMI-1640培養(yǎng)基，miR-27b-BMSC-exo組接種于miR-27b-BMSC-exo終濃度為80 μg·mL-1的RPMI-1640培養(yǎng)基；每組1塊6孔板，每孔加入1 mL培養(yǎng)基和1 mL細(xì)胞密度約為3×105個·mL-1的大鼠軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，置于溫度為37 ℃、二氧化碳濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。收集大鼠軟骨細(xì)胞，按照2.3的方法進行RT-qPCR檢測。

2.6 miR-27b-BMSC-exo影響大鼠軟骨細(xì)胞的觀察

2.6.1大鼠軟骨細(xì)胞的分組處理 取一定量培養(yǎng)至第2或第3代的大鼠軟骨細(xì)胞，分為4組。對照組于RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不進行干預(yù)，IL-1β組在IL-1β終濃度為10 ng·mL-1的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，miR-27b-BMSC-exo組在IL-1β終濃度為10 ng·mL-1、miR-27b-BMSC-exo終濃度為80 μg·mL-1的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，BMSC-exo 組在IL-1β終濃度為10 ng·mL-1、BMSC-exo終濃度為80 μg·mL-1的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)；每組1塊6孔板，每孔加入1 mL培養(yǎng)基和1 mL細(xì)胞密度約為3×105個·mL-1的大鼠軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，置于溫度為37 ℃、二氧化碳濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.6.2大鼠軟骨細(xì)胞的活力測定 分別于0 h、1 h、2 h、3 h、4 h和8 h收集一定量的各組細(xì)胞，接種到96孔板中，每組細(xì)胞接種6個復(fù)孔，每孔細(xì)胞個數(shù)約為3000個。根據(jù)噻唑藍(lán)試劑說明，采用MTT法檢測每個孔的吸光度。

2.6.3大鼠軟骨細(xì)胞中軟骨損傷相關(guān)蛋白的表達(dá)分析 于培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞，使用蛋白抽提試劑盒提取總蛋白。采用Western Blot檢測caspase-3前體、切割-caspase-3、caspase-9前體、切割caspase-9、MMP-13蛋白的表達(dá)，步驟同2.2.3中Western Blot步驟，其中caspase-3前體、切割-caspase-3、caspase-9前體、切割-caspase-9等MMP-13、β-actin兔抗鼠一抗的使用比例分別為1∶500、1∶700、1∶400、1∶600、1∶500、1∶2000，辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG二抗的使用比例為1∶1 000。拍照后采用Image-J圖像處理軟件處理圖片，提取蛋白條帶的灰度值，并分別以β-actin蛋白和對照組為基準(zhǔn)進行2次標(biāo)準(zhǔn)化處理，計算蛋白條帶的相對灰度值，比較蛋白的相對表達(dá)水平。

2.7 miR-27b-BMSC-exo影響骨軟骨復(fù)合體移植治療軟骨缺損的觀察

2.7.1骨軟骨復(fù)合體的制備 將直徑3.5 mm、高 3.0 mm、孔隙率91%～96%的圓柱體PLGA支架經(jīng)多聚賴氨酸浸泡12 h，再用500 mg·L-1的環(huán)氧乙烷在55 ℃滅菌12 h，然后在無菌室靜置5 d，使用無菌PBS漂洗，干燥后保存于干燥器中以備用。取一定量培養(yǎng)至第2或第3代的大鼠軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，分為3組，分別接種于RPMI-1640培養(yǎng)基、BMSC-exo終濃度為80 μg·mL-1的RPMI-1640培養(yǎng)基、miR-27b-BMSC-exo終濃度為80 μg·mL-1的RPMI-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，制備chon、BMSC-exo-chon、miR-27b-BMSC-exo-chon的細(xì)胞培養(yǎng)液。將PLGA支架放置于培養(yǎng)皿中，用PBS濕潤后，分別加入1 mL細(xì)胞密度約為5×104個·mL-1的chon、BMSC-exo-chon、miR-27b-exo-chon的細(xì)胞培養(yǎng)液，于溫度為37 ℃、二氧化碳濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。檢測細(xì)胞密度，待細(xì)胞密度達(dá)到1.5×104個·mm-3，將骨軟骨復(fù)合體置于4 ℃下保存。

2.7.2軟骨缺損SD大鼠模型的建立 將18只8周齡SD雌性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用腹腔注射鹽酸氯胺酮注射液進行麻醉，鹽酸氯胺酮的用量為80 mg·kg-1。于SD大鼠左后肢膝關(guān)節(jié)取髕骨內(nèi)側(cè)縱形切口，使髕骨側(cè)方脫位，顯露膝關(guān)節(jié)；使用直徑4.0 mm的空心鉆在股骨遠(yuǎn)端滑車溝槽制造直徑4.5 mm、深度1 mm的軟骨缺損，建立軟骨缺損SD大鼠模型。

2.7.3骨軟骨復(fù)合體植入軟骨缺損SD大鼠 采用隨機數(shù)字表將18只軟骨缺損SD大鼠隨機分為3組，對照組植入chon-PLGA骨軟骨復(fù)合體，miR-27b-BMSC-exo組植入miR-27b-BMSC-exo-chon-PLGA骨軟骨復(fù)合體，BMSC-exo組植入BMSC-exo-chon-PLGA骨軟骨復(fù)合體。將骨軟骨復(fù)合體填塞于骨缺損處，使關(guān)節(jié)創(chuàng)面平滑，恢復(fù)脫位的髕骨，逐層縫合切口，加壓包扎。

2.7.4SD大鼠軟骨修復(fù)觀察 SD大鼠術(shù)后飼養(yǎng)12周，采取脊椎脫臼法處死。切取股骨遠(yuǎn)端，暴露軟骨創(chuàng)面進行觀察。取含有創(chuàng)面的骨組織制備石蠟切片，在切片后分別采用HE、番紅O-固綠、ABH/OG試劑盒進行染色，于顯微鏡下觀察。

2.7.5SD大鼠軟骨組織中軟骨損傷修復(fù)標(biāo)志蛋白的表達(dá)分析 取切片后的石蠟切片，加入抗原修復(fù)液進行抗原修復(fù)。加入兔抗鼠的Ⅱ型膠原蛋白、MMP-13一抗孵育20 min，抗體使用比例分別為1∶600、1∶800，用PBS洗滌3次，加入生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗孵育2 h，抗體使用比例為1∶2000。根據(jù)DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒說明進行顯色。顯色后用蒸餾水沖洗，再使用蘇木精復(fù)染，于顯微鏡下觀察，拍照后采用Image-Pro plus 6.0圖像分析軟件處理，并比較軟骨損傷修復(fù)標(biāo)志蛋白的表達(dá)陽性率。

2.7.6SD大鼠軟骨組織中軟骨損傷相關(guān)蛋白的表達(dá)分析 取SD大鼠含創(chuàng)面的新鮮軟骨組織，磨成勻漿后，使用蛋白抽提試劑盒提取總蛋白。采用Western Blot檢測caspase-3前體、切割-caspase-3、caspase-9前體、切割-caspase-9、MMP-13蛋白的表達(dá)，步驟同2.2.3 Western Blot，兔抗鼠 caspase-3 前體、切割-caspase-3、caspase-9前體、切割-caspase-9、MMP-13、β-actin一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗的使用比例與2.6.3相同。采用Image-J圖像處理軟件處理圖片，提取蛋白條帶的灰度值，并以β-actin蛋白為基準(zhǔn)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計算蛋白條帶的相對灰度值，比較蛋白的相對表達(dá)水平。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用GraphPad Prism 5.0進行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。CD9和CD63蛋白表達(dá)的相對灰度值、miR-27b相對表達(dá)量的組間比較采用t檢驗；大鼠軟骨細(xì)胞活力的比較采用重復(fù)測量資料的方差分析；軟骨損傷相關(guān)蛋白表達(dá)的相對灰度值、軟骨損傷修復(fù)標(biāo)志蛋白表達(dá)陽性率的組間總體比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié) 果

3.1 BMSC-exo的鑒定結(jié)果BMSC-exo為圓盤形囊泡狀膜結(jié)構(gòu)(圖1)，粒徑92～115 nm，數(shù)量占比最高的BMSC-exo的粒徑為106 nm(圖2)；BMSC-exo的Zeta電位為(-22.13±2.1)mV。BMSC-exo表面標(biāo)記物CD9和CD63在BMSC-exo組的表達(dá)量顯著高于BMSC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3、表1)。

3.2 miR-27b表達(dá)的檢測結(jié)果miR-27b在miR-27b-BMSC組BMSC中的表達(dá)量高于BMSC組(相對表達(dá)量：46.785±8.153，1.000±0.280，t=13.748，P=0.000)，miR-27b在miR-27b-BMSC組exo中的表達(dá)量高于BMSC組(相對表達(dá)量：34.825±8.612，1.000±0.325，t=9.621，P=0.000)。見圖4。

BMSC：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；exo：外泌體。

BMSC：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；exo：外泌體。

BMSC：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；exo：外泌體；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶，為內(nèi)參蛋白。

表1 BMSC和BMSC-exo表面標(biāo)記蛋白的相對表達(dá)量

3.3 大鼠軟骨細(xì)胞對miR-27b-BMSC-exo的攝取情況大鼠軟骨細(xì)胞和miR-27b-BMSC-exo共培養(yǎng)4 h，miR-27b-BMSC-exo被大鼠軟骨細(xì)胞攝取(圖5)。

3.4 共培養(yǎng)后大鼠軟骨細(xì)胞中miR-27b表達(dá)的檢測結(jié)果miR-27b 在miR-27b-BMSC-exo組大鼠軟骨細(xì)胞中的表達(dá)量高于BMSC-exo組(相對表達(dá)量：3.315±0.523，1.000±0.244，t=9.826，P=0.000)。見圖6。

3.5 miR-27b-BMSC-exo對大鼠軟骨細(xì)胞的影響

3.5.1大鼠軟骨細(xì)胞活力的測定結(jié)果 時間因素與分組因素存在交互效應(yīng)。4組大鼠軟骨細(xì)胞活力總體比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，即存在分組效應(yīng)。培養(yǎng)前及培養(yǎng)1 h、2 h，大鼠軟骨細(xì)胞活力的組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；培養(yǎng)3 h、4 h、8 h，大鼠軟骨細(xì)胞活力的組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，IL-1β組的大鼠軟骨細(xì)胞活力小于對照組、miR-27b-BMSC-exo組、BMSC-exo組(3 h：P=0.002，P=0.011，P=0.026；4 h：P=0.002，P=0.002，P=0.006；8 h：P=0.004，P=0.004，P=0.011)，miR-27b-BMSC-exo組的大鼠軟骨細(xì)胞活力大于對照組和BMSC-exo組(3 h：P=0.019，P=0.023；4 h：P=0.015，P=0.002；8 h：P=0.003，P=0.029)。不同時間點大鼠軟骨細(xì)胞活力總體比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，即不存在時間效應(yīng)。見圖7、表2。

miR：microRNA；BMSC：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；exo：外泌體。

miR：microRNA；BMSC：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；exo：外泌體。

miR：microRNA；BMSC：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；exo：外泌體。

IL：白細(xì)胞介素；miR：microRNA；BMSC：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；exo：外泌體。

3.5.2大鼠軟骨細(xì)胞中軟骨損傷相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果 切割-caspase-3、切割-caspase-9和MMP-13的表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。IL-1β組大鼠軟骨細(xì)胞切割-caspase-3、切割-caspase-9和MMP-13的表達(dá)量高于對照組、miR-27b-BMSC-exo組、BMSC-exo組(切割-caspase-3：P=0.025，P=0.020，P=0.006；切割-caspase-9：P=0.011，P=0.008，P=0.036；MMP-13：P=0.034，P=0.003，P=0.009)； miR-27b-BMSC-exo組大鼠軟骨細(xì)胞中切割-caspase-3、切割-caspase-9和MMP-13的表達(dá)量低于BMSC-exo組(P=0.023，P=0.010，P=0.007)。見圖8、圖9、表3。

IL：白細(xì)胞介素；miR：microRNA；BMSC：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；exo：外泌體；caspase：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶；β-actin：β肌動蛋白。

IL：白細(xì)胞介素；miR：microRNA；BMSC：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；exo：外泌體；caspase：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶。

表2 4種不同因素干預(yù)后不同時間點4組大鼠軟骨細(xì)胞的活力

3.6SD大鼠軟骨缺損修復(fù)效果直視下觀察，miR-27b-BMSC-exo組SD大鼠軟骨損傷修復(fù)效果優(yōu)于對照組和BMSC-exo組(圖10)。病理染色結(jié)果顯示，對照組軟骨層較薄，邊緣不規(guī)則，軟骨下骨和軟骨無界限；miR-27b-BMSC-exo組和BMSC-exo組軟骨層較厚，邊緣光滑，軟骨下骨和軟骨界限清晰，且miR-27b-BMSC-exo組透明軟骨修復(fù)效果優(yōu)于BMSC-exo組(圖11至圖13)。

表3 4種不同因素干預(yù)24 h后4組大鼠軟骨細(xì)胞中軟骨損傷相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量

miR：microRNA；BMSC：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；exo：外泌體。

miR：microRNA；BMSC：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；exo：外泌體;左側(cè)圖放大40倍；右側(cè)圖放大200倍。

3.7SD大鼠軟骨組織中軟骨損傷修復(fù)標(biāo)志蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果免疫組織化學(xué)染色顯示，對照組和BMSC-exo組SD大鼠軟骨組織中MMP-13高表達(dá)，miR-27b-BMSC-exo組SD大鼠軟骨組織中MMP-13低表達(dá)(圖14)；對照組SD大鼠軟骨組織中Ⅱ型膠原蛋白低表達(dá)，BMSC-exo組和miR-27b-BMSC-exo組SD大鼠軟骨組織中Ⅱ型膠原蛋白高表達(dá)(圖15)。MMP-13、Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)陽性率的組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，miR-27b-BMSC-exo組SD大鼠軟骨組織Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)量高于對照組和BMSC-exo組(P=0.005，P=0.012)，MMP-13的表達(dá)量低于對照組和BMSC-exo組(P=0.029，P=0.014)。見表4。

3.8SD大鼠軟骨組織中軟骨損傷相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果切割-caspase-3、切割-caspase-9和MMP-13的表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。miR-27b-BMSC-exo組切割-caspase-3、切割-caspase-9和MMP-13的表達(dá)量均低于對照組和BMSC-exo組(切割-caspase-3：P=0.003，P=0.006；切割-caspase-9：P=0.001，P=0.019；MMP-13：P=0.007，P=0.008)。見圖16、圖17、表5。

miR：microRNA；BMSC：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；exo：外泌體。

miR：microRNA；BMSC：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；exo：外泌體。

miR：microRNA；BMSC：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；exo：外泌體；MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶。

miR：microRNA；BMSC：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；exo：外泌體。

表4 骨軟骨復(fù)合體移植后12周3組SD大鼠軟骨組織中MMP-13和Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)陽性率

miR：microRNA；BMSC：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；exo：外泌體；β-Actin：β肌動蛋白；caspase：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶。

4 討 論

BMSC的外泌體所含成分較多，主要包括miRNA、mRNA、蛋白質(zhì)等，這些成分在細(xì)胞通信中發(fā)揮重要作用[14]。miRNA種類繁多，主要參與轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)調(diào)控，但大多數(shù)miRNA的生理功能尚不清楚。Zhou等[15]研究表明，miR-27b能夠顯著降低大鼠軟骨細(xì)胞中促凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)、提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而抑制大鼠軟骨細(xì)胞的凋亡。蘇永蔚等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在軟骨細(xì)胞炎癥模型大鼠的關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射miR-27b-BMSC-exo，能夠減緩關(guān)節(jié)軟骨退行性病變，具有明顯的抗炎作用。我們通過實驗證明了miR-27b能夠在BMSC以及BMSC-exo中高表達(dá)，且大鼠軟骨細(xì)胞能夠攝取miR-27b-BMSC-exo；而在大鼠軟骨細(xì)胞攝取miR-27b-BMSC-exo后，能夠在大鼠軟骨細(xì)胞中檢測到miR-27b過表達(dá)，為進一步觀察miR-27b-BMSC-exo-chon-PLGA骨軟骨復(fù)合體移植治療軟骨缺損的效果并探究其作用機制奠定了基礎(chǔ)。

Caspase是一類天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，包括caspase-3，caspase-6，caspase-7，caspase-8、caspase-9等，其中caspase-8、caspase-9是細(xì)胞凋亡的啟動者，而caspase-3、caspase-6、caspase-7是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者[17]。Choi等[18]研究發(fā)現(xiàn)，caspase-3在骨缺損模型中高表達(dá)。Ren等[19]研究發(fā)現(xiàn)，caspase-9的表達(dá)與大鼠軟骨細(xì)胞凋亡以及軟骨損傷的發(fā)展密切相關(guān)。Jiang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，抑制caspase-9的激活可以顯著降低高糖誘導(dǎo)的軟骨終板細(xì)胞凋亡。我們給予大鼠軟骨細(xì)胞炎癥刺激后，切割-caspase-3、切割-caspase-9的表達(dá)量顯著增高，而加入miR-27b-BMSC-exo能夠顯著降低切割-caspase-3和切割-caspase-9的表達(dá)水平，且在軟骨缺損模型SD大鼠的軟骨組織中也表現(xiàn)出相同的結(jié)果。Zhou等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-27b能夠抑制大鼠軟骨細(xì)胞中的caspase-3和caspase-9的表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。因此，miR-27b-BMSC-exo促進軟骨細(xì)胞修復(fù)可能與其抑制caspase-3、caspase-9的表達(dá)有關(guān)，在大鼠軟骨細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮了抑制軟骨細(xì)胞凋亡的作用。

miR：microRNA；BMSC：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；exo：外泌體；caspase：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶。

表5 骨軟骨復(fù)合體移植后12周SD大鼠軟骨組織中軟骨損傷相關(guān)蛋白的表達(dá)結(jié)果

MMP家族是組織修復(fù)和重塑的重要調(diào)節(jié)酶。在關(guān)節(jié)中，MMP的過度表達(dá)會導(dǎo)致軟骨基質(zhì)的降解以及軟骨細(xì)胞的凋亡，最終導(dǎo)致軟骨的破壞，引起關(guān)節(jié)病變。Ⅱ型膠原蛋白占關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)膠原蛋白的90%～95%。研究表明，MMP-13對Ⅱ型膠原蛋白的降解作用最強，且Ⅱ型膠原蛋白亦被MMP-13優(yōu)先降解[21-22]。MMP-13是與軟骨退行性病變的發(fā)病機制密切相關(guān)的一種金屬蛋白酶[23-24]。Piecha等[25]報道了一種強效的選擇性MMP-13抑制劑，能夠顯著抑制人類骨關(guān)節(jié)炎中的軟骨降解。因此，抑制MMP-13的表達(dá)是抑制軟骨基質(zhì)降解、促進軟骨缺損修復(fù)的重要方法。Akhtar等[9]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠軟骨細(xì)胞被IL-1β刺激后，miR-27b的表達(dá)急劇下調(diào)，MMP-13的表達(dá)顯著增加，而過量表達(dá)miR-27b的大鼠軟骨細(xì)胞中，MMP-13的表達(dá)被顯著抑制。Xu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠關(guān)節(jié)軟骨中過表達(dá)miR-27b可以抑制Ⅹ型膠原蛋白和MMP-13的表達(dá)，并促進Ⅱ型膠原蛋白mRNA和蛋白水平上調(diào)。我們的早期實驗也證實了miR-27b能夠抑制大鼠軟骨細(xì)胞中MMP-13的表達(dá)，而本研究采用miRNA-27b-BMSC-exo-chon-PLGA骨軟骨復(fù)合體植入軟骨缺損的SD大鼠，結(jié)果顯示SD大鼠骨軟骨移植修復(fù)軟骨缺損的效果顯著提高，而軟骨損傷相關(guān)蛋白的檢測結(jié)果也顯示MMP-13的表達(dá)顯著下降，提示其作用機制可能與miR-27b抑制MMP-13的表達(dá)，進而抑制軟骨基質(zhì)降解、促進軟骨缺損修復(fù)有密切關(guān)系。

本研究結(jié)果表明，miRNA-27b-BMSC-exo-chon-PLGA骨軟骨復(fù)合體移植治療軟骨缺損，能夠顯著提高治療效果，其作用機制可能與抑制caspase-3、caspase-9以及MMP-13的表達(dá)、促進Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)有關(guān)，但具體的作用機制仍需進一步深入研究。