彭代平，湯小虎，李東云，丁 喆，周瑞彬

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，云南 昆明 650011；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650021）

桂枝是發(fā)散風(fēng)寒藥，性溫，具有調(diào)和營衛(wèi)、溫通經(jīng)脈、散寒止痛的功效。前期文獻(xiàn)研究[1]發(fā)現(xiàn)桂枝廣泛用于治療痹病的名方中，同時實驗研究[2-3]也發(fā)現(xiàn)桂枝溫通經(jīng)脈相關(guān)配伍對膠原關(guān)節(jié)炎大鼠模型的血清促炎性因子有下調(diào)作用。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）發(fā)病的主要病機是本虛標(biāo)實，氣血虧虛，陰陽失調(diào)，營衛(wèi)失和，風(fēng)寒濕熱邪外侵，經(jīng)絡(luò)痹阻而致，營衛(wèi)氣血失和是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[4-6]，故在治療RA時調(diào)和營衛(wèi)很重要。本研究選取桂枝調(diào)和營衛(wèi)配伍組合干預(yù)風(fēng)寒濕痹型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠，觀察其對促炎性細(xì)胞因子及骨破壞的影響，探討其防治RA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性Wistar大鼠80只，體質(zhì)量（200±20）g，購自成都達(dá)碩生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2014-028。于云南省中醫(yī)醫(yī)院中心實驗室SPF級動物房飼養(yǎng)，環(huán)境溫度（21±3）℃，濕度（55±5）%，12 h光暗循環(huán)至實驗結(jié)束，飼養(yǎng)期間大鼠可自由獲取潔凈飲用水和食物，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。

1.2 主要藥物與試劑 甲氨喋呤片（2.5 mg，批號：036130413），上海信誼藥廠有限公司；桂枝配方顆粒（0.5 g相當(dāng)生藥重 3 g，批號：1306175），白芍配方顆粒（1 g相當(dāng)生藥重 10 g，批號：1307089），赤芍配方顆粒（1.5 g相當(dāng)生藥重 10 g，批號：1307070），當(dāng)歸配方顆粒（4 g相當(dāng)生藥重 10 g，批號：1309148），熟地配方顆粒（4 g相當(dāng)生藥重 10 g，批號：1309107），均為江陰天江藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；牛Ⅱ型膠原購自四川大學(xué)；完全弗氏佐劑（BD 公司，貨號：263810）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）檢測試劑盒（BD公司，貨號：558535），IL-6檢測試劑盒（BD 公司，貨號：550319），IL-1β 檢測試劑盒（R&D 公司，貨號：RRA00）。

1.3 主要儀器 Biofuge Primo R離心機（德國Thermo Scientific Heraeus公司）；酶標(biāo)儀（美國BioTeK公司）；分析天平（METTLER TOLEDO公司）；電子秤（上海友聲衡器有限公司）；YLS-7B足趾容積測量儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司）；光學(xué)顯微鏡（LEICA DM2500）。

1.4 造模及給藥 將80大鼠隨機選取正常組10只，其余70只建立風(fēng)寒濕痹CIA模型；將100 mg牛Ⅱ型膠原溶于20 mL（0.1 mol/L）的醋酸中，置于4℃過夜，再與等容積的完全弗氏佐劑混合，制備Ⅱ型膠原終濃度為2.5 mg/mL的混合物，然后用注射器反復(fù)抽吸，直至混合物完全、充分乳化，以乳化物滴入水中不松散為度；取乳化后的混合物，于麻醉的大鼠尾根、背部皮內(nèi)各注射0.1 mL，并壓迫注射部位30 s使乳化物吸收完全。正常組給予同等劑量的生理鹽水皮內(nèi)注射。免疫后第14天，參照文獻(xiàn)[2]并改進(jìn)，模擬自然風(fēng)寒濕環(huán)境，建立RA風(fēng)寒濕痹模型，將造模大鼠置于（7±3）℃冷水中，水深1 cm中站立30 min，同時伴以4～5級風(fēng)力，每天1次，連續(xù)刺激7 d。于免疫后第21天進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分（AI），AI≥2分即為造模成功[7-8]，并隨機分為模型組、桂枝白芍組、桂枝赤芍組、桂枝當(dāng)歸組、桂枝熟地組、甲氨喋呤組，每組10只。根據(jù)臨床常用劑量（桂枝20 g，白芍20 g，赤芍20 g，當(dāng)歸20 g，熟地30 g）按“人和大鼠之間體表面積折算”等效劑量灌胃給藥，即每天給藥量：桂枝白芍組3.6 g/kg，桂枝赤芍組3.6 g/kg，桂枝當(dāng)歸組3.6 g/kg，桂枝熟地組4.5 g/kg；甲氨喋呤組1.5 mg/kg，每周給藥1次；空白組和模型組給予蒸餾水灌胃；給藥容積為1 mL/100g，連續(xù)給藥21d。

1.5 觀察及檢測指標(biāo)

1.5.1 觀察大鼠體質(zhì)量變化 從分組給藥當(dāng)日開始測量體質(zhì)量，每1周測量1次。

1.5.2 觀察大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評分 于給藥前及給藥7、14、21d各進(jìn)行1次AI評分，評價方法參照文獻(xiàn)[9]。0分：無紅斑或腫脹；1分：輕微的紅斑和1個趾關(guān)節(jié)腫脹；2分：紅斑和超過1個趾關(guān)節(jié)的腫脹；3分：紅斑和踝部或腕部腫脹；4分：全部紅斑以及腳趾和踝部或手指和腕部的腫脹，踝或腕不能彎曲。四肢評分之和（最高分為16分）為AI，分值越高代表關(guān)節(jié)炎程度越嚴(yán)重。

1.5.3 測量大鼠足爪容積 使用YLS-7B足趾容積測量儀測量大鼠雙后足爪容積并于踝關(guān)節(jié)處標(biāo)記，給藥前及給藥7、14、21 d各進(jìn)行1次大鼠雙后足爪容積測量，并采用（雙后足爪容積之和/2）計算出每1只后爪的容積。

1.5.4 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6的測定 給藥21 d，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血并處死大鼠，待血液凝固后，置離心機于4℃，3 500 r/min，離心10 min后分裝血清，采用ELISA法（按試劑盒說明書程序進(jìn)行操作）檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 含量。

1.5.5 大鼠踝關(guān)節(jié)病理變化 大鼠處死后，取雙后肢踝關(guān)節(jié)，于10%中性緩沖福爾馬林進(jìn)行固定，浸洗、脫鈣、脫水、透明、石蠟包埋、切片后蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察踝關(guān)節(jié)的病理變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布的計量資料組間比較采用單因素方差分析，方差齊時兩兩比較采用LSD法分析，方差不齊的資料采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組體質(zhì)量變化比較 分組給藥前，與正常組比較，模型組和各給藥組大鼠體質(zhì)量較輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），但各給藥組與模型組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；給藥 21 d時，模型組及各給藥組大鼠體質(zhì)量低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），各給藥組與模型組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；從體質(zhì)量增長情況來看，正常組大鼠體質(zhì)量增長較模型組和各給藥組明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），但模型組大鼠體質(zhì)量增長較各給藥組緩慢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 各組對大鼠體質(zhì)量變化的影響（±s，g）

表1 各組對大鼠體質(zhì)量變化的影響（±s，g）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

n 給藥前 給藥21 d 體質(zhì)量增長10 387.90±30.49 443.70±35.30 55.80±13.84 10 319.40±32.62**348.60±36.01**29.20±7.76**桂枝白芍 10 320.67±35.98**360.61±42.56**39.94±8.85**##桂枝赤芍 10 324.40±28.94**363.85±37.10**39.45±8.75**##桂枝當(dāng)歸 9 319.22±26.38**359.39±34.29**40.17±6.91**##桂枝熟地 10 317.25±30.77**358.75±34.37**41.50±8.00**##甲氨喋呤 10 329.50±40.92**373.80±49.38**44.30±12.92**##組別正常模型

2.2 各組大鼠AI比較 同正常組比較，模型組大鼠AI評分均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，給藥前及給藥7、14 d時各藥物組大鼠AI評分差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；給藥21 d時，各給藥組大鼠AI評分均低于模型組，其中桂枝白芍、桂枝赤芍、桂枝當(dāng)歸及甲氨喋呤組明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。各給藥組組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組CIA大鼠AI評分比較（±s，分）

表2 各組CIA大鼠AI評分比較（±s，分）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

n 給藥前 給藥21 d 10 0.00±0.00 0.00±0.00 10 5.90±2.42** 7.00±2.16**桂枝白芍 10 6.11±2.26 4.56±2.51#桂枝赤芍 10 5.80±2.35 4.40±2.17#桂枝當(dāng)歸 9 5.78±2.82 4.56±2.55#桂枝熟地 10 5.80±2.53 4.70±2.45甲氨喋呤 10 5.70±2.83 4.50±2.55#組別正常模型給藥7 d 0.00±0.00 6.20±2.20**6.22±2.39 5.80±2.53 5.89±2.89 6.10±3.11 5.90±3.07給藥14 d 0.00±0.00 7.10±2.33**5.67±2.29 4.90±2.08 5.22±3.03 5.90±3.07 5.50±3.03

2.3 各組大鼠后爪容積比較 在給藥前及給藥7、14、21 d，模型組大鼠后爪容積均大于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；給藥前各藥物組大鼠后爪容積與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；給藥7、14 d時，各藥物組大鼠后爪容積較模型組有不同程度下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；給藥21d時，各藥物組大鼠后爪容積較模型組明顯下降（P＜0.05）。見表3。

表3 各組CIA大鼠后爪容積比較（±s，mL）

表3 各組CIA大鼠后爪容積比較（±s，mL）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

n 給藥前 給藥21 d 10 1.97±0.06 2.20±0.08 10 2.99±0.80** 3.04±0.55**桂枝白芍 10 3.04±0.71 2.55±0.43#桂枝赤芍 10 2.96±0.59 2.57±0.37#桂枝當(dāng)歸 9 2.94±0.85 2.54±0.45#桂枝熟地 10 2.92±0.74 2.48±0.34#甲氨喋呤 10 2.91±0.81 2.57±0.43#組別正常模型給藥7 d 2.06±0.07 3.00±0.75**3.02±0.57 2.86±0.62 2.92±0.81 2.86±0.68 2.79±0.72給藥14 d 2.13±0.07 3.06±0.61**2.78±0.56 2.73±0.50 2.75±0.65 2.58±0.41 2.67±0.56

2.4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平較正常組明顯升高（P＜0.05或 P＜0.01）；與模型組比較，各藥物組大鼠血清TNF-α、IL-6水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；各給藥組大鼠血清 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（±s，pg/mL）

表4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（±s，pg/mL）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

n TNF-α IL-1β IL-6 10 10.10±2.30 15.76±2.51 35.94±22.47 10 15.13±1.81** 19.87±3.06* 114.03±40.30**桂枝白芍 10 12.43±2.28# 18.81±4.01 57.54±14.61##桂枝赤芍 10 11.00±2.57## 19.39±4.48 59.48±29.41##桂枝當(dāng)歸 9 12.54±2.93# 19.45±2.78 48.21±17.85##桂枝熟地 10 11.04±1.90## 17.27±4.01 39.61±12.47##甲氨喋呤 10 11.60±2.53## 18.19±3.86 49.48±18.65##組別正常模型

2.5 各組大鼠關(guān)節(jié)病理變化情況 正常組大鼠關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)清楚完整，關(guān)節(jié)軟骨表面規(guī)則光華，軟骨細(xì)胞呈橢圓形，排列整齊；模型組可見關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞大量增生，大量炎癥細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主，關(guān)節(jié)軟骨及骨組織破壞，增生的纖維組織向骨髓腔內(nèi)侵入生長；桂枝白芍、桂枝赤芍、桂枝當(dāng)歸、桂枝熟地組可見少量成纖維樣滑膜細(xì)胞增生，關(guān)節(jié)面粗糙不規(guī)則，可見骨質(zhì)破壞，炎癥細(xì)胞浸潤；甲氨喋呤組大鼠滑膜組織輕中度增生，軟骨細(xì)胞排列不整齊，關(guān)節(jié)軟骨層變薄，關(guān)節(jié)面粗糙，骨質(zhì)破壞，有淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)病理變化HE染色（×200）

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要特征的常見自身免疫病，其主要病理表現(xiàn)為滑膜炎、血管翳形成，逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失[10]。雖然RA病因復(fù)雜，發(fā)病機制尚不完全明確，但促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6在驅(qū)動RA關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)破壞起關(guān)鍵的作用[11-13]。TNF-α、IL-1β 均可以激活 NF-κB通路，誘導(dǎo)血管血管細(xì)胞黏附因子（VCAM-1）、內(nèi)皮生長因子（VEGF）等多種細(xì)胞因子生成，促進(jìn)RA滑膜炎癥和血管翳的形成[14-15]。TNF-α和IL-1β通過上調(diào)核因子κB受體活化因子配體（RANKL）表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞生成，介導(dǎo)RA骨破壞[16-17]。IL-6主要是參與成纖維細(xì)胞的激活和增殖、破骨細(xì)胞分化等，可通過JAK/STAT3和WNT通路促進(jìn)OC分化和抑制OB生成，導(dǎo)致RA骨破壞[18-19]。

RA屬于中醫(yī)“痹癥”“歷節(jié)風(fēng)”“尪痹”等范疇。張仲景《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)病脈證并治》提出：“榮氣不通，衛(wèi)不獨行，榮衛(wèi)慎微，三焦無所御，四屬斷絕，身體羸瘦，獨足腫大，黃汗出，脛冷。假令發(fā)熱，便為歷節(jié)也?！薄额愖C治裁·痹證》載：“諸痹……良由營衛(wèi)先虛，腠理不密，風(fēng)、寒、濕乘虛內(nèi)襲，正氣為內(nèi)所阻，不能宣行，因而留滯，氣血凝澀，久而成痹?！薄夺t(yī)林繩墨》曰：“大率痹由氣血虛弱、榮衛(wèi)不能和通，致令三氣乘于腠理之間?！笨梢姞I衛(wèi)失和在痹證的發(fā)病中至關(guān)重要?，F(xiàn)代醫(yī)家國醫(yī)大師徐經(jīng)世認(rèn)為氣血不足、營衛(wèi)失調(diào)是尪痹發(fā)生的重要內(nèi)部原因[20]；姜泉教授認(rèn)為尪痹之起，一則邪氣乘體虛侵入，二則營衛(wèi)之氣不和[21]；馬文輝教授認(rèn)為營衛(wèi)傾移是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的核心機制之一[22]?？傊盃I衛(wèi)氣血失和”是RA發(fā)病的重要原因，在臨床中使用頻率較高前3味中藥有當(dāng)歸、桂枝、白芍[23-25]，桂枝白芍、桂枝當(dāng)歸配伍是較常用的配伍，也從側(cè)面證實了“調(diào)和營衛(wèi)氣血”治療的重要性，特別是RA的早期。

桂枝味辛、甘，性溫，具有發(fā)汗解肌、溫通經(jīng)脈、助陽化氣之功?！侗静菥V目》曰：“桂枝透營達(dá)衛(wèi)，故能解肌而風(fēng)邪去，脾主營，肺主衛(wèi)，甘走脾，辛走肺也?！薄侗静莘纸?jīng)》謂：“桂枝溫經(jīng)通脈，發(fā)汗解肌，調(diào)和營衛(wèi)。”桂枝辛溫發(fā)散走表而入衛(wèi)分，入衛(wèi)則溫衛(wèi)，甘溫走脾能通達(dá)血脈而入營分，入營則和營，故有調(diào)和營衛(wèi)、溫通經(jīng)脈之功。芍藥苦酸甘、微寒，歸肝脾二經(jīng)，具有養(yǎng)血涼血，斂陰和營止痛的功效；與桂枝相合，一營一衛(wèi)，一收一散，起到調(diào)和營衛(wèi)、散風(fēng)斂營和解肌發(fā)表之功。當(dāng)歸甘、辛、溫，歸肝、心、脾經(jīng)，其味甘而重，善于補血，其氣輕而辛，又能行血，補中有動，行中有補，為補血行血之要藥，具有養(yǎng)血活血、通補兼?zhèn)洹⒀a虛祛瘀之功效；與桂枝配伍，溫中有補，補中有行，溫通行血，使血虛瘀滯，血得濡養(yǎng)，瘀滯得行，寒凝得溫則通，起到溫經(jīng)通絡(luò)、調(diào)和氣血之功。熟地甘、微溫，歸肝、腎經(jīng)，甘溫質(zhì)潤，善滋補腎陰益精以生血，為滋陰養(yǎng)血補虛之要藥；與桂枝配伍，一陰一陽，一血一氣，溫潤宣通經(jīng)脈，起到調(diào)和氣血陰陽、溫通養(yǎng)血之功。

本研究中桂枝與白芍、桂枝與赤芍、桂枝與當(dāng)歸、桂枝與熟地配伍具有調(diào)和營衛(wèi)氣血之功，對風(fēng)寒濕環(huán)境刺激CIA模型大鼠體重增長和關(guān)節(jié)炎指數(shù)不同程度改善；桂枝調(diào)和營衛(wèi)氣血配伍組合能明顯減輕CIA大鼠后足容積，抑制CIA大鼠血清炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的表達(dá)，發(fā)揮抗炎及減輕骨破壞，但其具體分子機制尚需進(jìn)一步研究。