李河橋，劉紹明，孫櫻菲，張修舉

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院泌尿外科，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院泌尿男科，北京 100163；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院男科，北京 100091）

精子生成是一系列細(xì)胞事件，與睪丸精子生成或睪丸后成熟有關(guān)的分子事件的干擾可能導(dǎo)致不孕不育。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，全球近1.9億人患有不孕不育，其中因男性因素所致者占到半數(shù)[1]。各種條件可以不同程度地影響男性的生殖潛力，它們往往共存[2]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激（OS）在男性不孕癥病因?qū)W中起著獨(dú)立的作用，其中超過(guò)半數(shù)的男性，基質(zhì)活性氧物種水平表達(dá)過(guò)多[3]。OS可以通過(guò)多種途徑對(duì)生育產(chǎn)生負(fù)面影響，包括電容干擾和精子細(xì)胞膜、DNA可能受損，這可能損害精子受精卵并發(fā)育成健康胚胎的潛力[4-5]。然而，精子擁有發(fā)達(dá)的抗氧化防御網(wǎng)絡(luò)，包括抗氧化基因和酶，在保護(hù)精子的活力和生存能力方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。抗氧化基因Nrf2（核因子紅細(xì)胞2+相關(guān)因子2）促進(jìn)抗氧化酶表達(dá)，是抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分[6]。本團(tuán)隊(duì)前期臨床研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，二仙解毒方以補(bǔ)腎益精、活血解毒為組方思想，可以提高精液質(zhì)量、精子的活動(dòng)力（progressive and non-progressive，PR+NP），調(diào)整氧化應(yīng)激狀態(tài)。為了明確二仙解毒方對(duì)弱精子癥（asthenospermia，AS）大鼠睪丸及附睪組織Nrf2蛋白表達(dá)的影響，本研究通過(guò)建立AS大鼠模型，對(duì)此進(jìn)行研究，以進(jìn)一步闡述為二仙解毒方的臨床起效作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取SPF級(jí)SD健康雄性大鼠72只，8周，體質(zhì)量 200～250 g，統(tǒng)一購(gòu)于斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)科技有限公司。

1.2 藥物 二仙解毒方：熟地黃15 g，牡丹皮9 g，丹參 9 g，枸杞子 12 g，茯苓 9 g，車前子 9 g，仙茅 9 g，淫羊藿9 g，菟絲子12 g，黃精9 g，巴戟天12 g，萆薢9 g，白花蛇舌草15 g，蒲公英12 g，配方顆粒購(gòu)自北京康仁堂藥業(yè)有限公司。

左卡尼汀口服液：國(guó)藥準(zhǔn)字H19990372，東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司，規(guī)格：10mL；奧立泰：國(guó)藥準(zhǔn)字H20031257，西安萬(wàn)隆制藥股份有限公司，規(guī)格：0.25 g。

1.3 主要及試劑 EPS 300電泳儀（biorad）；低溫離心機(jī)（Sigma，德國(guó)）；LEGEND MICRO 21R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（THERMO）；熒光定量PCR儀（Applied biosystems（USA））；分光光度計(jì)（THERMO）；TRIZOL（10296028，Invitrogen）；SuperScript III RT 逆轉(zhuǎn)錄 kit（11752050，ABI-invitrogen）；Sybr qpcr mix（4472920，ABI-invitrogen）；DJ-1（ab18257，Abcam）。

1.4 方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、二仙解毒方低劑量組、中劑量組、高劑量組、左卡尼汀組，每組各12只。除空白組外，剩下各個(gè)實(shí)驗(yàn)組采取奧硝唑法制備AS模型[9]。二仙解毒方各組均以二仙解毒方濃縮液生藥予以灌胃，其中二仙解毒方低劑量組灌胃劑量為7.5 g生藥/kg；中劑量組灌胃劑量為15 g生藥/kg；高劑量組灌胃劑量為生藥30 g/kg；左卡尼汀組灌胃劑量為左卡尼汀口服液0.1 g/kg；空白組、模型組：予生理鹽水10 mL/kg體重灌胃。各組灌胃持續(xù)4周。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 大鼠精子活動(dòng)力檢測(cè) 末次給藥24 h后處死大鼠，分離睪丸、附睪，取左側(cè)睪丸和附睪置于37℃生理鹽水的平皿中，稱重后將附睪橫切分為大致均勻的上下兩部分，將左側(cè)上半部分剪碎的附睪組織移入孵育緩沖液試管中。自大鼠輸精管及附睪中留取精液標(biāo)本，進(jìn)一步行精子活力檢測(cè)。

1.5.2 精液氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 取左側(cè)下半部分睪丸、附睪組織，分別用4℃的生理鹽水在冰水浴中制成10%的組織勻漿，離心速度為3 000 r/min，持續(xù)10 min，收集上清液并冷凍保存，各小組蛋白表達(dá)將采用分光光度法進(jìn)行。SOD檢測(cè)用黃嘌呤氧化法；選用硫代巴比妥法來(lái)進(jìn)行MDA檢測(cè)；考馬斯亮藍(lán)法被用來(lái)檢測(cè)GSH-Px；采用熒光探針測(cè)定精子ROS；具體步驟說(shuō)明書實(shí)施。

1.5.3 Western Blot檢測(cè)睪丸、附睪組織Nrf2蛋白的表達(dá) 從-80℃冰箱中取出樣品，蛋白上樣量為20 μg，進(jìn)行電泳后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上室溫封閉 2 h；以 Nrf2抗體（兔源，1∶5 000）為第一抗體，HRP-山羊抗兔IgG（1：6 000稀釋）為第二抗體進(jìn)行孵育；漂洗后加入發(fā)光液，顯影、定影。用Quantity One對(duì)蛋白條帶的灰度進(jìn)行定量，以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量用來(lái)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5.4 RT-PCR檢測(cè)睪丸、附睪組織Nrf2基因的轉(zhuǎn)錄取另一側(cè)大鼠睪丸組織，用RNA simple Total試劑盒提取總RNA，用Rever TraAce qPCR RT kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)目的基因及管家基因引物，以cDNA為模板，采用 SYBR Green進(jìn)行PCR檢測(cè)。同時(shí)測(cè)定待測(cè)樣品的管家基因（β-actin）及目的基因Ct值和對(duì)照組管家基因（β-actin）及目的基因Ct值，其中數(shù)據(jù)相對(duì)定量分析，將通過(guò)2－△△CT法計(jì)算。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來(lái)表示；滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)選擇單因素方差分析來(lái)實(shí)現(xiàn)多個(gè)小組之間的比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01表示差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 精子密度及活動(dòng)力比較 對(duì)比空白組與模型組大鼠精子濃度，結(jié)果表明不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而PR+NP精子百分率下降，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），說(shuō)明AS大鼠成功造模。與模型組比較，二仙解毒方低劑量組精子密度升高（P＜0.05）；其余各組精子密度顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，二仙解毒方低、中、高劑量組、左卡尼汀組中精子活動(dòng)力PR+NP精子均上升，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。見表2。

表2 不同濃度二仙解毒方對(duì)大鼠精子的改變（±s）

表2 不同濃度二仙解毒方對(duì)大鼠精子的改變（±s）

注：與模型組相比，*P＜0.05；**P＜0.01。

組別 數(shù)量 精子密度/（×106·L-1）PR+NP/%空白組 12 39.17±4.62** 60.23±1.72**模型組 12 15.06±4.17 41.06±1.19二仙解毒方低劑量組 12 19.94±2* 45.51±1.52**二仙解毒方中劑量組 12 22.83±4.65** 49.43±0.77**二仙解毒方高劑量組 12 31.30±4.04** 62.31±1.12**左卡尼汀組 12 33.16±3.96** 57.21±0.85**

2.2 不同濃度二仙解毒方對(duì)大鼠精液氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 與正常組比較，模型組SOD、GSH-Px水平顯著降低（P＜0.01），MDA、ROS水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各組SOD、GSH-Px含量明顯上升（P＜0.01），MDA、ROS含量明顯下降（P＜0.01），且二仙解毒方劑量越高，氧化應(yīng)激指標(biāo)改變?cè)斤@著。此外，二仙解毒方高劑量組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)與空白組相比，二者未表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），提示二仙解毒方高劑量組可將模型組大鼠的精液抗氧化能力恢復(fù)至正常大鼠水平。見圖1。

圖1 不同濃度二仙解毒方對(duì)大鼠精液氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響（±s）

2.3 二仙解毒方對(duì)大鼠附睪、睪丸Nrf2 mRNA表達(dá)的影響 在附睪組織中，與模型組比較，空白組，二仙解毒方低、中、高劑量組Nrf2 mRNA的表達(dá)都顯著上升（P＜0.01），左卡尼汀組中 Nrf2 mRNA 同樣上升（P＜0.05）。睪丸組織中，各組Nrf2 mRNA表達(dá)均顯著提高，具有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。見表3。

表3 二仙解毒方對(duì)大鼠附睪、睪丸組織Nrf2 mRNA表達(dá)的影響

2.4 二仙解毒方對(duì)大鼠附睪、睪丸組織Nrf2蛋白表達(dá)的影響 附睪組織中，與空白組相比較，模型組大鼠Nrf2蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），表明弱精子癥大鼠Nrf2蛋白受影響。除左卡尼汀組（P＞0.05）外，各組Nrf2蛋白表達(dá)均有所上升，有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），說(shuō)明西藥治療弱精子癥的主要靶點(diǎn)不在Nrf2蛋白上；其中高劑量組與空白組比較，結(jié)果顯示不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），說(shuō)明二仙解毒方高劑量組效果最好，能在實(shí)驗(yàn)層面恢復(fù)大鼠Nrf2蛋白表達(dá)。睪丸組織中，相對(duì)于模型組，二仙解毒方中劑量組蛋白表達(dá)較高，且有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；空白組和高劑量組蛋白表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；二仙解毒方低劑量組和左卡尼汀組Nrf2蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。提示在恢復(fù)蛋白表達(dá)上，二仙解毒方效果明顯，左卡尼汀無(wú)顯著效果。見圖2。

圖2 不同濃度二仙解毒方對(duì)大鼠附睪睪丸組織Nrf2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

弱精子癥臨床常見，降低了懷孕幾率，影響胚胎質(zhì)量。專家共識(shí)指出，脾腎兩虛夾瘀為弱精子癥纏綿難愈的關(guān)鍵病機(jī)，故治療要以健脾益腎、活血養(yǎng)精為基本治法[10]。尤在涇《金匱要略心典》載：“毒，邪氣蘊(yùn)結(jié)不解之謂”[11]。目前一些高輻射、物理化學(xué)性等有害成分可歸于中醫(yī)之“毒邪”。毒邪無(wú)所出路，日久蘊(yùn)積體內(nèi)，損傷精室，進(jìn)一步致使精子活力下降。因此，弱精子癥不僅有脾腎不足的“本虛”，也有血瘀和毒素積聚過(guò)多的“標(biāo)實(shí)”[12-13]。二仙解毒方是由張景岳“贊育丹”化裁所成，在原方基礎(chǔ)上加入活血之牡丹皮、丹參，祛濕之茯苓、車前子、萆薢，白花蛇舌草、蒲公英清熱解毒。全方不僅補(bǔ)腎之陰陽(yáng)，而且兼顧瘀血、毒邪。研究表明，淫羊藿、巴戟天可以調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸，菟絲子配伍枸杞子可以改善雷公藤多苷導(dǎo)致的精子異常[14-15]。丹參水提物能促進(jìn)小鼠睪丸生精功能的恢復(fù)，減少精子DNA損傷[16]，是治療弱精子癥的有效藥物。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究也已證明，健脾益腎活血解毒法可以增加睪丸組織清除活性氧、抵抗氧化損傷的能力，提升精子生存狀態(tài)，促使精子運(yùn)動(dòng)力上升[17-19]。據(jù)了解，世界人口約15%受不育癥的影響[20]，其中超過(guò)25%的男性不孕癥病例是特發(fā)性的，沒有可識(shí)別的原因[21]。氧化應(yīng)激（OS）和活性氧物種（ROS）被認(rèn)為對(duì)精子有害，占不孕癥病例的30%～80%[22]。OS對(duì)男性群體的生育力和精子功能造成了較大的傷害。Nrf2可以維持細(xì)胞內(nèi)的氧化平衡，降低細(xì)胞對(duì)死亡信號(hào)的敏感性，在細(xì)胞抵抗外源性或內(nèi)源性氧化應(yīng)激的機(jī)制中起重要作用。在Nrf2缺乏的小鼠中，精子濃度和運(yùn)動(dòng)能力將受到損害[23]。此外，有證據(jù)表明，與受孕男性精子中的Nrf2表達(dá)相比，男性不育者精子的Nrf2表達(dá)水平較低[24]。因此，Nrf2作為一種抗氧化基因，通過(guò)抑制氧化應(yīng)激來(lái)維持精子動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)性非常重要[25]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，二仙解毒方能顯著提高精子活動(dòng)力，能改變氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、GSH-Px、SOD、ROS，改善弱精子癥大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)，有助于恢復(fù)氧化與抗氧化的“動(dòng)態(tài)平衡”。二仙解毒方能增加大鼠睪丸和附睪中Nrf2基因的表達(dá)。服用二仙解毒方后，大鼠睪丸、附睪組織中Nrf2蛋白表達(dá)顯著提高，提示二仙解毒方改善精子活力可能與Nrf2通路激活有關(guān)。

此外，本實(shí)驗(yàn)觀察到，二仙解毒方高劑量組在改善氧化應(yīng)激狀態(tài)及提高Nrf2 mRNA、Nrf2蛋白表達(dá)效果顯著，多數(shù)指標(biāo)恢復(fù)到空白組大鼠水平，表明二仙解毒方確有提高精子活動(dòng)力、改善精子微環(huán)境的作用，使之有恢復(fù)至正常水平的可能性。二仙解毒方可以減少甚至逆轉(zhuǎn)奧硝唑誘導(dǎo)睪丸和附睪的病理?yè)p傷；二仙解毒方高劑量組療效優(yōu)于左卡尼汀，體現(xiàn)出中醫(yī)藥治療疾病的優(yōu)勢(shì)之處，但由于少弱精子癥病理機(jī)制較為復(fù)雜，二仙解毒方是否可通過(guò)調(diào)控其他蛋白及通路來(lái)改善精子微環(huán)境功能，尚有待于進(jìn)一步研究。