黃 巖，李茂業(yè)，劉 蘇，劉明科，丁朝陽，齊禹哲，閆雪梨，錢逸彬，徐逸凡，閆芳芳

（1.安徽農業(yè)大學植物保護學院/植物病蟲害生物學與綠色防控安徽普通高校重點實驗室，合肥 230036；2.四川省煙草公司攀枝花市公司，攀枝花 617026）

昆蟲病原真菌在自然界中分布廣泛，在農業(yè)害蟲生物防治中具有重要的應用價值和開發(fā)潛力。當前許多科研工作者已發(fā)現(xiàn)了多種昆蟲病原真菌，包括布氏白僵菌Beauveriabrongniartii、金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae、蠟蚧輪枝菌Lecanicilliumlecanii、玫煙色棒束孢Paecilomycesfurmosoroseus等[1]。刀孢蠟蚧菌Lecanicilliumpsalliotae是蠟蚧菌中的一類具有廣譜性的昆蟲病原真菌，對煙粉虱Bemisia tabaci、桃蚜Myzuspersicae和假眼小綠葉蟬Empoascavitis等農林業(yè)害蟲均具有較強的侵染能力[2]。蠟蚧輪枝菌對煙粉虱的致死中濃度（LC50）僅需 1×107個孢子/mL[3]。刀孢蠟蚧菌在低濃度條件下，菌懸液濃度為 1.66×103個孢子/mL時，對豆蔻薊馬Sciothripscardamomi的致死率為 62.9%[4]，對假眼小綠葉蟬Empoascavitis控制效果達到50.9%[5]。此外，蠟蚧輪枝菌對扶桑綿粉蚧Phenacoccussolenopsis也具有較高毒力，袁盛勇[6]報道該菌對扶桑綿粉蚧2齡若蟲的LC50僅為1.66×103個孢子/mL。除了單獨使用外，應用昆蟲病原真菌和天敵協(xié)同防治害蟲可以得到較好的結果[7]。鄭珊珊等[8]將濃度為5×107個孢子/mL的蠟蚧輪枝菌菌懸液噴施到纓小蜂Schizophragmaparvulas體表對假眼小綠葉蟬進行防治，結果表明對假眼小綠葉蟬的控制效果最高可達90.8%。

蠟蚧菌也可以與某些農藥進行復配，產生協(xié)同增效作用。莽逸倫[9]報道蠟蚧菌孢子懸浮液與印楝素混用后，大豆蚜Aphisglycines累計校正死亡率為94.16%，而單獨施用蠟蚧菌孢子懸浮液的處理最高累積校正死亡率為76.64%。

近年來的研究表明，蠟蚧菌能夠通過直接寄生和產生代謝產物兩種方式來控制線蟲和綠霉菌等植物病原微生物。趙洋[10]報道蠟蚧菌產生的幾丁質酶對南方根結線蟲卵孵化的抑制作用明顯，使用幾丁質酶原液的處理組，卵的抑制率達到83.17%。此外，蠟蚧菌對作物的生長發(fā)育也具有一定的促進作用[11]。

近年來，由于化學農藥的濫用[12]，導致土壤污染，作物農殘過高，害蟲產生抗藥性等一系列問題。而利用昆蟲病原真菌對害蟲進行生物防治，則能在一定程度上減輕對環(huán)境的破壞。因此，基于昆蟲病原真菌的害蟲防治技術近年來受到廣泛關注[13]。昆蟲病原真菌的大規(guī)模工業(yè)生產是使其在田間得以大范圍應用的前提。由于不同種昆蟲病原真菌對初始接菌量、溫度、碳源和氮源的偏好情況不同，明確昆蟲病原真菌最適培養(yǎng)條件有利于減少昆蟲病原真菌工業(yè)生產成本，增加產品產量。刀孢蠟蚧菌作為一種重要的昆蟲病原真菌，目前還鮮有對該菌株培養(yǎng)條件的報道。

為了明確刀孢蠟蚧菌HFLP006的最適培養(yǎng)條件，本研究以一株對桃蚜Myzuspersicae（Sulzer）高毒力的刀孢蠟蚧菌 HFLP006為對象，比較了該菌在不同初始接菌量、溫度、碳源和氮源條件下的生長情況和產孢量，并對桃蚜進行了毒力測定，以期明確該刀孢蠟蚧菌菌株的最佳培養(yǎng)條件。本研究為昆蟲病原真菌的培養(yǎng)提供了嶄新的思路，對菌株HFLP006的大規(guī)模工業(yè)生產和生物防治應用均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

供試刀孢蠟蚧菌 HFLP006由貴州省貴陽市開陽縣馬場煙葉試驗田中的桃蚜蟲體獲得，在安徽農業(yè)大學植物保護學院生物防治實驗室分離保藏。試驗前，用接種環(huán)挑取一定量孢子接種到SDAY固體培養(yǎng)基上，在26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，活化備用。

1.2 供試昆蟲

供試桃蚜于2019年采自四川省瀘州市煙草試驗基地，在安徽農業(yè)大學植物保護學院人工氣候室內用煙草（云煙 87）飼養(yǎng)多代，飼養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃，光周期 16D:8L，RH＞85%。挑選大小一致，有較強活力的無翅成蚜置于提前洗凈的煙草葉片上，12 h后將成蚜挑出，留下葉片上的若蚜繼續(xù)飼養(yǎng)，待若蚜發(fā)育至成蚜，挑取最后一次脫皮1～2 d內活力強的無翅成蚜作為供試蟲源。

1.3 最適培養(yǎng)基的篩選

基礎培養(yǎng)基：葡萄糖2.2 g，蛋白胨0.2 g，K2HPO40.1 g，無水MgSO40.05 g，純水100 mL，pH 7.0。SDAY液體培養(yǎng)基：葡萄糖4.0 g，蛋白胨1.0 g，酵母浸粉1.0 g，純水100 mL。PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯20 g（削去外皮，開水煮沸20 min，用紗布濾去殘渣），葡萄糖2.0 g，純水100 mL。

1.4 最適初始接菌量的篩選

將培養(yǎng)10 d的菌株HFLP006在無菌條件下接入SDAY液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在（26±0.3）℃，光周期16D:8L，轉速為120 r/min的恒溫搖床培養(yǎng)10 d，測其孢子濃度，待濃度達到108個孢子/mL時吸取菌液，按0.5%、1%、2%、4%和8%的接菌量分別接入PDA和SDAY液體培養(yǎng)基中，每個濃度重復3次，在恒溫搖床連續(xù)培養(yǎng)7 d，首次接入48 h后使用血球計數(shù)板在顯微鏡下測其孢子濃度并觀測顏色變化。

1.5 最適溫度的篩選

將菌株HFLP006以1%接菌量接入SDAY液體培養(yǎng)基，在5個不同溫度（22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃和30 ℃）處理下，在光周期為16D:8L，轉速為120 r/min的恒溫搖床中連續(xù)培養(yǎng)7 d。每個溫度重復3次，測定方法同1.4。

1.6 最適碳源及氮源的篩選

在最適碳源篩選試驗中，將基礎培養(yǎng)基中的葡萄糖分別用另外5種碳源（可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇）替換，使其含碳量相同，配制成6種不同的碳源培養(yǎng)基；在最適氮源篩選試驗中，將基礎培養(yǎng)基中的蛋白胨分別用另外3種氮源（酵母浸粉、硝酸鉀、硫酸銨）替換，使其含氮量相同，配制成4種不同的氮源培養(yǎng)基。將菌株HFLP006以1%接菌量接入各處理培養(yǎng)基中，在26 ℃、光周期16D:8L、轉速120 r/min的恒溫搖床培養(yǎng)。每個處理重復3次，培養(yǎng)及測定方法同1.4。

1.7 對無翅桃蚜成蟲的毒力測定

吸取培養(yǎng)10 d的HFLP006孢子懸浮液（培養(yǎng)條件：SDAY液體培養(yǎng)基、26 ℃、光周期16D:8L、轉速120 r/min），在顯微鏡下用血球計數(shù)板計算孢子濃度，用無菌水將孢子懸浮液稀釋至1×107個孢子/mL。將孢子懸浮液用小噴壺噴在帶有無翅成蚜的煙草葉片上（每片煙葉 30頭桃蚜成蟲），噴施至煙草葉片完全濕潤，對照組試蟲噴施無菌水。待煙草葉片在室溫下晾干后，每個處理取3片煙葉（煙草中上部葉片），裝入透明保鮮盒，置于光周期16D:8L、溫度（26±1）℃光照培養(yǎng)箱中，連續(xù)觀察7 d，計算試蟲死亡率。試驗設置4次生物學重復。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Abbott公式計算出LD50和毒力回歸方程。采用鄧肯新復極差法，比較在不同培養(yǎng)基種類、不同初始接菌量、不同溫度、不同碳源及不同氮源條件下菌株產孢量差異性。所有數(shù)據(jù)均由DPS軟件完成統(tǒng)計分析。校正死亡率（%）＝（處理組死亡率—對照組死亡率）/（1—對照組死亡率）×100。

2 結果與分析

2.1 接菌量對刀孢蠟蚧菌生長狀況的影響

在不同接菌量條件下，供試刀孢蠟蚧菌HFLP006菌株產孢量情況如表1所示。在SDAY培養(yǎng)基中，各處理的最大產孢量的峰值出現(xiàn)在第7 d或第8 d，之后產孢量開始下降。菌株HFLP006在各時間段的產孢量均顯著高于其他接菌量處理組（F4,10＝71.43，P＜0.05）。在接菌量8%條件下，培養(yǎng)第8 d菌株HFLP006產孢量達到最大值（28.30×108個孢子/mL）。

表1 不同初始接菌量條件下刀孢蠟蚧菌產孢量的比較Table 1 Comparison in spore production of L.psalliotae under different initial inoculation density

在PDA培養(yǎng)基中，8%接菌量處理組在各時間段的產孢量均顯著高于其他接菌量處理組（F4,10＝91.39，P＜0.05），且在第8 d產孢量達到最高，為16.11×108個孢子/mL。此外，在各接菌量條件下，接種于SDAY培養(yǎng)基的菌株的最大產孢量均大于PDA培養(yǎng)基。

2.2 溫度對刀孢蠟蚧菌生長狀況的影響

菌株HFLP006在22 ℃～30 ℃條件下均可以生長并產生分生孢子（表2）。在22 ℃～24 ℃范圍內，培養(yǎng)2～5 d菌株HFLP006的產孢量隨溫度增加而增大。在28 ℃條件下，從第5 d開始菌株產孢量隨溫度增加而減少。菌株HFLP006在5個溫度條件下的最大產孢量存在明顯差異，該菌株在26 ℃培養(yǎng)6 d后，產孢量達到最大值16.92×108個孢子/mL，顯著高于其他處理組（F4,10＝301.90，P＜0.05）。

表2 不同培養(yǎng)溫度條件下刀孢蠟蚧菌產孢量的比較Table 2 Comparison in the amount of spores produced by L.psalliotae under different incubation temperatures

2.3 碳源對刀孢蠟蚧菌生長狀況的影響

菌株HFLP006在以甘露醇作為碳源的培養(yǎng)基中產孢量最大，在培養(yǎng)第6 d達到12.83×108個孢子/mL，顯著高于以蔗糖、麥芽糖、淀粉和乳糖為碳源的處理組（F5,12＝16.69，P＜0.05），但與碳源為葡萄糖的處理組之間差異不顯著（P＞0.05）。說明以甘露醇為碳源能夠促進菌株HFLP006產孢，但葡萄糖對該菌株的產孢也具有相似效果（表3）。

表3 不同碳源條件下刀孢蠟蚧菌產孢量的比較Table 3 Comparison in the amount of spores produced by L.psalliotae under different carbon sources

2.4 氮源對刀孢蠟蚧菌生長狀況的影響

菌株HFLP006在以酵母浸粉為氮源的條件下，在培養(yǎng)第6 d達到最大產孢量9.48×108個孢子/mL，顯著高于其他處理組（F3,8＝88.68，P＜0.05）。而以硫酸銨為氮源的處理組在各個培養(yǎng)時間的產孢量均為最低（表4）。

表4 不同氮源條件下刀孢蠟蚧菌產孢量的比較Table 4 Comparison in the amount of spores produced by the L.psalliotae under different nitrogen sources

2.5 刀孢蠟蚧菌對無翅桃蚜成蟲的致病力

菌株HFLP006對無翅成蚜的校正死亡率隨著時間的增加而上升，施菌后1～3 d，試蟲死亡率較低，而在施菌后3～5 d試蟲死亡率迅速上升。從第5 d開始致死率增長趨勢逐漸平緩，第7 d試蟲的校正死亡率達80.73%。計算獲得回歸方程為Y＝0.6705＋3.2672X，相關系數(shù)為0.8975，95%置信區(qū)間0.9622～1.6881，LD50為1.3251 g/mL。

3 討論

不同培養(yǎng)條件對昆蟲病原真菌的生長、性狀和產孢量均有顯著影響。其中，初始接菌量對菌株產孢量的影響最為直接。劉超等[14]研究了初始接菌量對致病病原真菌白色念珠菌Canidiaalbicans的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)初始接菌量越小白色念珠菌菌株受到外界因素的干擾就越小。在SDAY液體培養(yǎng)基中，當初始接菌量為8%時，菌株HFLP006獲得的最大產孢量顯著高于其他處理。但是從生產工藝層面考慮，若采用這一接菌量條件，會增加成本的投入，所以在生產實踐中采用何種接菌量應結合生產者自身及消費者的消費能力綜合考慮。此外，本試驗發(fā)現(xiàn)PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)效果低于SDAY培養(yǎng)基，而且在接菌后第3 d所有PDA處理組的菌懸液中均出現(xiàn)了白色結塊，干擾了后續(xù)孢子濃度的測定。推測該現(xiàn)象也會對刀孢蠟蚧菌的工業(yè)發(fā)酵造成影響。

培養(yǎng)溫度的高低直接影響刀孢蠟蚧菌菌株產孢量[15]。李戌清等[16]通過對一株分離自番茄葉片上的刀孢蠟蚧菌進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其雖在25 ℃～30 ℃條件下均能正常生長，但最適培養(yǎng)溫度為25 ℃。這一結果與本研究最適培養(yǎng)溫度26 ℃的結論略有差異，可能是與菌株采集地不同有關。謝佶芹等[17]在實驗室進行蛀蟲蠟蚧菌Lecanicilliumcauligalbarum最適生長溫度與營養(yǎng)條件試驗，得出蛀蟲蠟蚧菌最適生長溫度為25 ℃，說明不同種的蠟蚧菌所需最適溫度有一定差異。谷祖敏等[18]在研究2株蠟蚧菌耐熱性差異分析試驗中發(fā)現(xiàn)，28 ℃條件下蠟蚧菌 VL17和VL18菌株孢子萌發(fā)率分別達89.26%和91.83%。本試驗發(fā)現(xiàn)菌株 HFLP006最適培養(yǎng)溫度為 26 ℃的結論與他們所得出的最適溫度結論略有不同，原因可能是與不同種蠟蚧菌的生物學特性有關[19]。

供試培養(yǎng)基中的碳源在一定程度上影響著菌株的生長產孢。高利[20]在進行液體與固體培養(yǎng)幾種生防真菌的研究中發(fā)現(xiàn)葡萄糖對蠟蚧菌的生長有積極作用。本研究結果表明在接菌量相同的條件下，刀孢蠟蚧菌HFLP006在含有甘露醇和葡萄糖的液體培養(yǎng)基中均能正常生長。本試驗還發(fā)現(xiàn)可溶性淀粉作為碳源的處理，菌株產孢量不理想。原因可能是可溶性淀粉作為多糖[21]，不能被刀孢蠟蚧菌直接吸收利用，且可溶性淀粉需要提前加熱熔化形成膠體，操作步驟較為復雜，在生產上難以使用。

除了碳源之外，氮源也與真菌菌株的生長產孢有一定的相關性。姜靈[22]發(fā)現(xiàn)以氮源為蛋白胨的培養(yǎng)基中，蠟蚧輪枝菌菌株最大產孢量為 9.05×106個孢子/mL，而在酵母浸粉為氮源處理中最大產孢量為 6.05×106個孢子/mL。張召榮等[23]發(fā)現(xiàn)以蛋白胨作為氮源培養(yǎng)一株來自古巴的蠟蚧菌 CHLB5，在培養(yǎng)第 7 d產孢量可達3.96×1010個孢子/mL。本研究發(fā)現(xiàn)當以酵母浸粉為氮源時，刀孢蠟蚧菌HFLP006的最大產孢量顯著高于其他處理，這與Mehta等[24]的報道一致。供試氮源為酵母浸粉的處理的最大產孢量優(yōu)于其他氮源處理，表明酵母浸粉在本研究中是最適合刀孢蠟蚧菌生長產孢的氮源，這也說明刀孢蠟蚧菌 HFLP006與其他種蠟蚧菌嗜好氮源的種類不同。

在毒力測定中，刀孢蠟蚧菌 HFLP006對桃蚜無翅成蚜的侵染力較高，表明該菌株有應用于田間防治桃蚜的潛力。田佳等[25]從野外采集了一株球孢白僵菌菌株BQ-64，該菌株在濃度為1×107個孢子/mL時對桃蚜的最大校正死亡率僅為29.85%。本研究同樣使用1×107個孢子/mL的HFLP006菌懸液處理桃蚜，在第7 d校正死亡率為80.73%，所以本研究中刀孢蠟蚧菌更具有防治潛力。當前也有一些關于蠟蚧菌聯(lián)合使用的研究，孔瓊等[26]研究發(fā)現(xiàn)蠟蚧菌與3%啶蟲脒可濕性粉劑和20%丁硫克百威乳油復配后對蠟蚧菌的殺傷力最小，說明刀孢蠟蚧菌也許能與農藥復配，以提高防效，降低農藥使用量。

本研究從供試培養(yǎng)基種類、初始接菌量、溫度、碳源和氮源及菌株毒力測定6個方面研究獲得最大產孢量的培養(yǎng)條件，所培養(yǎng)的孢子對桃蚜具有較高侵染力，本研究結果對刀孢蠟蚧菌大規(guī)模工業(yè)生產和生物防治應用均具有重要意義。后續(xù)研究將重點關注菌株HFLP006的工業(yè)生產及該菌株與其他藥劑的相容性，使該菌株更好地應用于桃蚜生物防治。