竇 蕊，杜少芳，王 洋，荊小院，馬瑞燕，劉金龍*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)部/化學(xué)生態(tài)研究所，太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，太谷 030801）

隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，果樹的種植品種增多，數(shù)量增加，果園作為新型產(chǎn)業(yè)逐漸興起，與此同時(shí)，果園害蟲的侵害情況也日趨嚴(yán)重，其中為害最為嚴(yán)重的是梨小食心蟲。梨小食心蟲GrapholithamolestaBusck又名梨小蛀果蛾、東方果蠹蛾、桃折梢蟲等，簡(jiǎn)稱“梨小”，屬鱗翅目Lepidoptera 卷葉蛾科 Tortricidae，是一種世界性的果樹害蟲，主要以幼蟲蛀食梨、桃、蘋果、油桃、櫻桃等多種仁果類和核果類果樹的果實(shí)或新梢[1,2]。近年來，利用昆蟲性引誘劑來防治害蟲的方法受到廣泛推崇[3-5]。昆蟲性引誘劑可以用來監(jiān)測(cè)、誘殺和干擾交配等[6-8]，具有高效、無毒、無污染、不傷害天敵昆蟲等優(yōu)點(diǎn)[9-13]，昆蟲性信息素的相關(guān)研究和應(yīng)用倍受國(guó)內(nèi)外學(xué)者重視[14]。

在利用性引誘劑防治梨小食心蟲的工作中[15-17]，使用較多的是載有性引誘劑的反口橡皮塞誘芯。誘芯中的主要活性成分是順-8-十二碳烯醇乙酸酯（Z8-12:Ac），該化合物易揮發(fā)且不易溶于水[18]，其揮發(fā)量易受風(fēng)速、溫度、天氣狀況等外界條件的影響。性引誘劑的揮發(fā)量會(huì)直接影響到誘蟲量[19,20]，影響誘捕效果。為了獲得較好的誘捕效果和精確的監(jiān)測(cè)信息，必須要了解性誘芯在實(shí)際應(yīng)用中活性成分的殘留量與釋放速率。目前對(duì)誘芯中性引誘劑含量的測(cè)定主要依靠氣相色譜法[21,22]，少有文獻(xiàn)報(bào)道其他有效的分析方法。

本文試圖建立一種新方法，可用于測(cè)定梨小誘芯中Z8-12:Ac的含量。因?yàn)樵趬A性條件下，熒光物質(zhì)中性紅（NR）與β-環(huán)糊精（β-CD）形成包合物[23]，使得中性紅的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，又因?yàn)樵谙嗤瑮l件下，β-CD也可與Z8-12:Ac形成包合物[24]，而且預(yù)試驗(yàn)證明β-CD與Z8-12:Ac的包合能力強(qiáng)于其與NR的包合能力，所以會(huì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)包合作用而導(dǎo)致熒光猝滅現(xiàn)象?；谝陨习细?jìng)爭(zhēng)原理，本文在 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中首先形成β-CD-NR包合物，接著加入一定量的Z8-12:Ac溶液，測(cè)定熒光猝滅程度。根據(jù)熒光猝滅程度和Z8-12:Ac濃度間的關(guān)系，利用熒光猝滅法來測(cè)定Z8-12:Ac的含量，并將其應(yīng)用于田間誘芯活性成分的測(cè)定。本文可為蟲情監(jiān)測(cè)預(yù)報(bào)的精確性以及性誘芯的誘殺效果提供技術(shù)手段，避免因活性成分衰減而導(dǎo)致測(cè)報(bào)信息出現(xiàn)偏差。

1 材料與方法

1.1 儀器試劑

RF5301PC型熒光分光光度計(jì)（日本島津公司）；PHS-3C型精密酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）；SK5200H超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；AR224CN型電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）。

β-環(huán)糊精（β-CD，上海金穗生物科技有限公司），經(jīng)沸水重結(jié)晶兩次；中性紅（NR，上海金穗生物科技有限公司）；梨小食心蟲性誘劑 Z8-12:Ac（本實(shí)驗(yàn)室自主合成，色譜檢驗(yàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 92%[25]）；乙醇（體積分?jǐn)?shù)95%）；梨小食心蟲誘芯（中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所研制生產(chǎn)，含96個(gè)單體的橡膠板，單個(gè)約重0.300～0.5000 g），其他試劑均為分析純。

1.2 熒光測(cè)定方法

依次準(zhǔn)確移取7.0 mL 0.2 mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液（pH 7.4）、1.0 mL 1.0×10-3mol/L中性紅溶液、5.0 mL 1.0×10-2mol/Lβ-CD溶液于25.0 mL容量瓶中，搖勻靜置10 min后，加入一定量的5.0×10-3mol/L Z8-12:Ac溶液，或5.0 mL待測(cè)試液，雙蒸水定容，搖勻，在超聲波清洗器中超聲反應(yīng)20 min，然后放置于冰箱中冷卻到4 ℃，待上機(jī)測(cè)定。

在激發(fā)波長(zhǎng)為460 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為580 nm，在此條件下分別測(cè)定各試液的熒光強(qiáng)度F，以及Z8-12:Ac空白熒光強(qiáng)度F0，經(jīng)ΔF＝F0—F計(jì)算出熒光猝滅值。激發(fā)和發(fā)射光譜通帶寬度均為5.0 nm。

1.3 誘芯樣品液的制備

分別取未使用的和在室外放置14 d的梨小食心蟲誘芯各7個(gè)，用刀片把每個(gè)誘芯切成厚度約1 mm的碎片，并分別轉(zhuǎn)移到具塞三角瓶?jī)?nèi)，加入30.0 mL乙醇（95%，分析純），搖勻后在30 ℃水浴中放置2 h，使誘芯中的Z8-12:Ac盡可能溶解到溶劑中[26]。提取完畢后，移液管抽取上層清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾轉(zhuǎn)移入樣品瓶中，標(biāo)記為樣品液1和樣品液2，旋緊瓶蓋避光保存待測(cè)。

1.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)方法

按1.2的方法分別配制β-CD-NR體系溶液于兩個(gè)容量瓶中，均加入5.0 mL的樣品液1，向其中一份加入5.0 mL 1×10-4mol/L的Z8-12:Ac標(biāo)準(zhǔn)溶液，均定容至25.0 mL，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度猝滅值ΔF，由線性關(guān)系計(jì)算濃度。根據(jù)下式計(jì)算加標(biāo)回收率。樣品液2用同樣的方法處理。加標(biāo)回收率＝（加標(biāo)試樣測(cè)定值—試樣測(cè)定值）/加標(biāo)量×100%

1.5 田間試驗(yàn)

田間誘蛾試驗(yàn)地點(diǎn)選在山西省太谷縣西山底村的桃園。試驗(yàn)樹種為桃樹，樹齡 20～25年生，株行距為 4 m×4.5 m。誘捕器為三角形誘捕器（24 cm×18 cm×18 cm）[27]。在誘捕器內(nèi)部底面平鋪一塊長(zhǎng)方形（23 cm×17 cm）粘蟲板，將梨小食心蟲誘芯以細(xì)鐵絲固定后懸掛于粘蟲板上方。誘捕時(shí)，將誘捕器由鐵絲從上棱穿入，懸掛于樹枝遮蔽處，距離地面高度約為1.5 m，誘捕器間隔20 m 以上。根據(jù)地形和桃樹分布情況，劃分試驗(yàn)小區(qū)。1個(gè)試驗(yàn)小區(qū)共放置6個(gè)誘捕器，選擇其中1個(gè)誘捕器為對(duì)照（每次記錄后需替換未釋放的新誘芯），其余5個(gè)為持續(xù)釋放試驗(yàn)。設(shè)置3個(gè)小區(qū)為重復(fù)。每天定時(shí)記錄誘蟲量并更換粘蟲板。設(shè)置釋放時(shí)間分別為0、7、14、21、28 d，每天統(tǒng)計(jì)各個(gè)水平處理的誘蛾量，收集各處理水平的試驗(yàn)誘芯，密封保存，待測(cè)。

分別取3個(gè)同一處理水平的待測(cè)誘芯，按本文1.3的方法制備樣品液。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用 SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析；各處理的平均值采用Duncan氏多重比較法檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Z8-12:Ac對(duì)β-CD-NR體系熒光強(qiáng)度的影響

從圖1激發(fā)光譜（a）和發(fā)射光譜（b）可以看出，在堿性緩沖溶液中，中性紅（NR）水溶液的熒光強(qiáng)度較弱，其最大激發(fā)波長(zhǎng)為556 nm、最大發(fā)射波長(zhǎng)為605 nm；當(dāng)加入適量的β-CD后，熒光強(qiáng)度明顯增大，其最大激發(fā)波長(zhǎng)藍(lán)移至460 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)顯著藍(lán)移至580 nm，說明β-CD對(duì)體系有熒光增敏作用；在NR與β-CD的包合物溶液中加入Z8-12:Ac后，熒光強(qiáng)度降低，其中發(fā)射熒光強(qiáng)度降低幅度較大。并且Z8-12:Ac的加入量越大，體系熒光猝滅程度越明顯。故本試驗(yàn)根據(jù)Z8-12:Ac的濃度與發(fā)射熒光強(qiáng)度的猝滅值ΔF之間的相關(guān)性，使用工作曲線法測(cè)定Z8-12:Ac的含量。

圖1 激發(fā)光譜（a）與發(fā)射光譜（b）（pH 7.4）Fig.1 Excitation spectra (a) and emission spectra (b) (pH 7.4)

2.2 測(cè)定條件的優(yōu)化

2.2.1 緩沖溶液的選擇 因?yàn)樵谒嵝跃彌_溶液中β-CD不與質(zhì)子態(tài)的中性紅形成包合物，故按上述試驗(yàn)方法主要考察了弱堿緩沖溶液下的Tris-HCl緩沖溶液、KH2PO4-NaOH緩沖溶液、NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液和Britton-Robinson廣泛緩沖溶液對(duì)體系熒光猝滅強(qiáng)度的影響，每個(gè)緩沖溶液做3個(gè)重復(fù)，測(cè)定結(jié)果見圖2。NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中體系的ΔF比其他3種緩沖溶液的ΔF大且差異顯著，故選擇NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液作為體系介質(zhì)。

圖2 不同的緩沖溶液對(duì)應(yīng)的體系的ΔF值Fig.2 ΔF values of corresponding systems for different buffer media

2.2.2 pH及緩沖溶液體積的影響 分別選用了pH為7.0～8.0的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液進(jìn)行試驗(yàn)。隨pH的增大，體系的ΔF增大。在pH為7.4時(shí)，ΔF有最大值29.035±0.28；之后隨著緩沖液pH的增大，體系的ΔF逐漸減小，因此選定pH為7.4（圖3）。

圖3 不同的pH對(duì)應(yīng)體系的ΔF值Fig.3 ΔF values of corresponding systems for different pH

試驗(yàn)分別選擇了1.0～9.0 mL不同體積的pH 7.4的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液，按上述步驟進(jìn)行試驗(yàn)。隨緩沖溶液用量的增加，體系的ΔF逐漸增大，在加入7.0 mL時(shí)，ΔF達(dá)到最大26.835±0.425，繼續(xù)增大體積后，ΔF反而有所減小，因此選定緩沖溶液用量為7.0 mL（圖4）。

圖4 緩沖溶液的不同體積對(duì)應(yīng)體系的ΔF值Fig.4 ΔF values of corresponding systems with different volumes of buffer solution

2.2.3β-CD用量的影響 取7個(gè)25.0 mL容量瓶，分別加入1.0～7.0 mL 1.0×10-2mol/L的β-CD溶液，1.0 mL 5.0×10-3mol/L的Z8-12:Ac乙醇溶液，每個(gè)體積做3次重復(fù)。隨著β-CD加入量的增大，其熒光猝滅作用增強(qiáng)。當(dāng)β-CD的用量為5.0 mL時(shí)，體系有最大ΔF值為53.825±0.56，β-CD的用量繼續(xù)增加時(shí)ΔF值反而減小，故選擇β-CD溶液的用量為5.0 mL 1.0×10-2mol/L（圖5）。

圖5 不同用量的β-CD對(duì)應(yīng)體系的ΔF值Fig.5 ΔF values of β-CD with different dosage

2.2.4 中性紅用量的影響 取7個(gè)25.0 mL容量瓶，分別加入0.20～1.40 mL的1.0×10-3mol/L NR溶液，1.0 mL 5.0×10-3mol/L的Z8-12:Ac乙醇溶液，再加入其他試劑，雙蒸餾水加至刻度線定容，按試驗(yàn)方法充分反應(yīng)后測(cè)定熒光強(qiáng)度，每個(gè)劑量做3次重復(fù)。隨著中性紅用量的增加，其ΔF逐漸增大，當(dāng)中性紅的用量為1.0 mL時(shí)，體系的ΔF值最大，為30.016±0.563。繼續(xù)加入中性紅其ΔF又逐漸減小，故選擇中性紅用量為1.0 mL 1.0×10-3mol/L（圖6）。

圖6 不同用量的NR對(duì)應(yīng)體系的ΔF值Fig.6 ΔF values of NR with different dosage

2.2.5 超聲時(shí)間的影響 按上述試驗(yàn)步驟進(jìn)行試驗(yàn)，探究不同超聲時(shí)間對(duì)體系ΔF的影響。超聲反應(yīng)20 min，ΔF值最大為29.53±0.238，而且體系穩(wěn)定，故選擇超聲時(shí)間為20 min（圖7）。

圖7 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)應(yīng)體系的ΔF值Fig.7 ΔF values of corresponding systems with different reaction time

2.2.6 體系的穩(wěn)定時(shí)間 超聲反應(yīng)結(jié)束后會(huì)出現(xiàn)體系變渾濁的現(xiàn)象，不利于光度法測(cè)定。因此，將體系置于4 ℃冰箱中，并分別設(shè)計(jì)了10、20、30、40、50、60 min的冷卻時(shí)間，每個(gè)時(shí)間設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分別測(cè)定其熒光猝滅值，可以看出在4 ℃冷卻時(shí)，體系熒光猝滅值ΔF在20 min左右變化達(dá)到最大，為60.071±0.318，并且體系在60 min內(nèi)保持穩(wěn)定（圖8）。

圖8 不同穩(wěn)定時(shí)間對(duì)應(yīng)體系的ΔF值（4 ℃）Fig.8 ΔF value of corresponding systems with different stability time（4 ℃）

經(jīng)過以上條件優(yōu)化試驗(yàn)，熒光猝滅法測(cè)定Z8-12:AC的最佳條件為：7.0 mL 0.2 mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液（pH 7.4）、1.0 mL 1.0×10-3mol/L的中性紅溶液、5.0 mL 1.0×10-2mol/L的β-CD溶液于25.0 mL容量瓶中，搖勻靜置10 min后，加入一定量的Z8-12:Ac溶液或待測(cè)液，定容，搖勻，在超聲波清洗器中超聲反應(yīng)20 min，然后放置到4 ℃下冷卻20 min，上機(jī)測(cè)定。

2.3 方法學(xué)檢驗(yàn)

2.3.1 線性范圍及檢出限 在7個(gè)25.0 mL容量瓶中按上述方法要求分別加入相應(yīng)反應(yīng)液后，依次準(zhǔn)確加入0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 mL的5.0×10-3mol/L Z8-12:Ac標(biāo)準(zhǔn)溶液，定容至25.0 mL，使體系中 Z8-12:Ac 的含量依次為 1.0×10-4、1.5×10-4、2.0×10-4、2.5×10-4、3.0×10-4、3.5×10-4、4.0×10-4mol/L。按照上述優(yōu)化條件處理后，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，并計(jì)算出相應(yīng)的熒光猝滅值ΔF。通過線性回歸方程計(jì)算，表明體系的熒光猝滅值ΔF與Z8-12:Ac含量在1.0×10-4～4.0×10-4mol/L濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程為ΔF＝28.3c－16.8，R2＝0.9978（圖9）。

圖9 Z8-12:Ac的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Standard curve of Z8-12:Ac

對(duì)2.0×10-4mol/L的Z8-12:Ac標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行11次平行測(cè)定，得出其檢出限為1.25×10-5mol/L（S/N＝3）。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD為±1.5%，表明方法的靈敏度和精密度良好。

2.3.2 干擾物質(zhì)的影響 當(dāng)Z8-12:Ac的濃度為2×10-4mol/L時(shí)，相對(duì)誤差不超過±5%的條件下，按本試驗(yàn)方法考察了以下各干擾物質(zhì)的允許量（以倍數(shù)計(jì)），分別是：K+（50）、Na+（50）、Ca2+（50）、Mg2+（50）、NH4+（50）、NO3-（50）、果糖（25）、葡萄糖（50）、甘油（50）。

2.3.3 加標(biāo)回收率 準(zhǔn)確移取兩個(gè)樣品待測(cè)液5.0 mL，按試驗(yàn)方法測(cè)定Z8-12:Ac的含量，并按照方法1.4進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)?？梢钥闯鰞蓚€(gè)樣品的加標(biāo)回收率分別為 98%和 103.0%，均在誤差允許范圍內(nèi)，說明測(cè)定方法準(zhǔn)確度較好（表1）。

表1 樣品中Z8-12:Ac含量的測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 1 Determination results of Z8-12:Ac in samples (n=3)

2.4 田間試驗(yàn)結(jié)果

不同處理水平下，梨小食心蟲誘芯在田間的誘蟲量統(tǒng)計(jì)分析和Z8-12:Ac含量的測(cè)定結(jié)果見表2?？梢钥闯?，試驗(yàn)組單個(gè)誘芯中Z8-12:Ac平均含量，在不同天數(shù)處理下差異顯著，說明誘芯在使用中其活性成分含量持續(xù)衰減，符合性誘劑的理化特性。對(duì)照組單個(gè)誘芯7 d誘蛾總量在各個(gè)處理間差異顯著，在整個(gè)田間試驗(yàn)（28 d）出現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，符合梨小食心蟲成蟲期的消長(zhǎng)規(guī)律，而且羽化高峰期出現(xiàn)在第14～21 d。試驗(yàn)組單個(gè)誘芯7 d誘蛾總量在處理3和處理4之間差異不顯著，與其他處理差異顯著，整個(gè)田間試驗(yàn)期間（28 d）也出現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，雖符合梨小食心蟲成蟲期的消長(zhǎng)規(guī)律，但沒有精確反映出高峰期。由于對(duì)照組使用的是Z8-12:Ac足量的新誘芯，而試驗(yàn)組因持續(xù)揮發(fā)使得誘芯中Z8-12:Ac含量衰減，所以導(dǎo)致高峰期測(cè)報(bào)模糊。說明熒光猝滅法測(cè)定誘芯中性誘劑含量可用于考查田間誘芯含量的變化情況，以便校正測(cè)報(bào)信息。

表2 田間試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 2 Determination results in the field (n=3)

3 討論

梨小食心蟲性誘劑的主要成分為Z8-12:Ac，本文基于熒光猝滅法對(duì)誘芯中Z8-12:Ac的含量進(jìn)行了測(cè)定。β-CD-NR體系中加入 Z8-12:Ac后，熒光強(qiáng)度降低，推測(cè)原因可能是因?yàn)樵讦?CD-NR包合物體系中加入Z8-12:Ac后，致使中性紅從β-CD的疏水空腔擠出，導(dǎo)致體系的熒光強(qiáng)度降低；而且隨著Z8-12:Ac加入量的增大，置換出的中性紅越來越多，則生成的β-CD與Z8-12:Ac的包合物越多，體系熒光猝滅程度越大。利用Z8-12:Ac濃度與熒光猝滅值之間的線性關(guān)系來測(cè)定Z8-12:Ac含量，檢出限為1.25×10-5mol/L，建立了一種新型測(cè)定 Z8-12:Ac的方法，本方法具有熒光體系穩(wěn)定、分析成本低、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。梨小性誘芯中Z8-12:Ac的含量可用氣相色譜法測(cè)定[22]，但由于氣相色譜法屬于痕量分析，進(jìn)樣量較小，使得測(cè)定結(jié)果精密度不好，而本試驗(yàn)方法學(xué)驗(yàn)證相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為±1.5%，表明方法靈敏度和精密度好。目前關(guān)于Z8-12:Ac的測(cè)定檢出限尚未見報(bào)道，本試驗(yàn)得出其檢出限為 1.25×10-5mol/L（S/N＝3），可滿足誘芯中含量的測(cè)定。誘芯中活性成分的含量與田間監(jiān)測(cè)、蟲情預(yù)報(bào)和誘殺效果有關(guān)，所以在實(shí)際應(yīng)用中對(duì)誘芯含量的測(cè)定十分重要。

使用昆蟲性信息素來防治害蟲，既環(huán)保又有好的防治效果，會(huì)在以后大量推廣。本試驗(yàn)方法可為其他種類的性信息素測(cè)定提供思路。但尚有很多問題需要解決：1、提取方法和溶劑還需要改進(jìn)和完善；2、采用熒光猝滅法定量分析Z8-12:Ac時(shí)，雖然穩(wěn)定性比氣相色譜好，但還是達(dá)不到氣相色譜法或氣相色譜-質(zhì)譜法的靈敏度[21,22]，因此下一步工作可以嘗試使用其他β-CD的衍生物或者使用其他熒光試劑進(jìn)行熒光猝滅試驗(yàn)，來提高熒光猝滅法測(cè)定的靈敏度，為性誘芯的實(shí)際測(cè)定提供更準(zhǔn)確靈敏的方法依據(jù)；3、雖然此方法可以進(jìn)行含量測(cè)定，但所建立的工作曲線的線性范圍還較小，在濃度太高（5.0×10-4～1.0×10-3mol/mL）或者太低（1.0×10-5～7.0×10-5mol/mL）時(shí)，熒光猝滅值ΔF和Z8-12:Ac的濃度c有線性關(guān)系但其線性相關(guān)性較差，回歸系數(shù)僅為0.9233和0.9125，不滿足分析方法的要求，因此關(guān)于工作曲線的線性范圍還需要進(jìn)一步的深入研究。