朱紹志，王 芳，孔珊珊，李文清，馬電通，李賢忠，鄧 佳，3

(1 西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，昆明，650224；2 西南林業(yè)大學(xué)國家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點實驗室，昆明，650224；3 西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點實驗室，昆明，650224)

葡萄柚(CitrusparadiseMacf.)，又稱西柚，是蕓香科柑桔屬植物中的一種，世界柑桔四大類群之一[1-2]。葡萄柚營養(yǎng)價值高，味酸甜略帶苦味,主要用以鮮食、果汁等，深受消費者喜愛[2]。目前，中國是全球葡萄柚(含柚類)栽培面積和生產(chǎn)大國[3]，國內(nèi)市場以鮮果消費為主[4]。但葡萄柚鮮果采后由于各種霉腐菌，尤其是Penicilliumitalicum(意大利青霉，引發(fā)青霉病)、Penicilliumdigitatum(指狀青霉，引發(fā)綠霉病)等青霉屬病原菌的危害[5],腐爛嚴(yán)重。一些發(fā)展中國家缺乏相應(yīng)的貯藏設(shè)備和防腐技術(shù)，損失高達(dá)50%[6]，給葡萄柚貯藏、銷售帶來巨大的困難。因此，應(yīng)對葡萄柚采后病害，急需尋找安全、高效、廉價的防腐措施。

目前，對葡萄柚采后病害的防治方法主要有化學(xué)方法、物理方法和生物方法?；瘜W(xué)殺菌劑是目前果蔬防腐使用最廣泛的防治方法，但長期使用化學(xué)殺菌劑會使病原菌產(chǎn)生抗藥性，且藥物殘留也會對人體健康、環(huán)境及動植物等產(chǎn)生危害[7-9]。物理方法主要為低溫冷藏，但成本高，不易大量商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。生物防治已被證明是一種有效的果蔬采后病害防控新途徑[10]。其中，酵母菌的來源極其廣泛[11]，具有安全、高效、抗逆性強(qiáng)、遺傳穩(wěn)定、不產(chǎn)生抗生素等優(yōu)勢，在鮮果采后病害防治上具有巨大的開發(fā)潛能，有望成為一種補(bǔ)充傳統(tǒng)化學(xué)殺菌劑和冷藏技術(shù)的新型防腐技術(shù)[12]。

目前已報道的具有生防效果的拮抗酵母菌有40余種，主要為假絲酵母屬(Candida)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、畢赤酵母屬(Pichia)等[13]。目前，國外對葡萄柚拮抗酵母菌的研究已有一些報道。如：Droby等[14]用含有68 mmol/L或者136 mmol/L氯化鈣的季也蒙畢赤酵母(Pichiaguilliermondii)懸液(107CFU/mL)，可將葡萄柚綠霉病的發(fā)病率從27%降低到3%。Droby等[15]研究了嗜油性假絲酵母菌(Candidaoleophila)應(yīng)用于葡萄柚、柑桔表面?zhèn)诨蛲暾墓麑嵄砻?，均可引起葡萄柚或者柑桔果實采后對主要病原?P.digitatum)的系統(tǒng)性抗性。目前，國內(nèi)對葡萄柚拮抗酵母菌的研究還少有報道。Wang等[16]研究表明，羧甲基殼聚糖與羅倫隱球酵母菌(Cryptococcuslaurentii)聯(lián)合處理，比單一處理更能有效地保持葡萄柚果實品質(zhì)和控制采后腐爛。

在本研究中，筆者選取云南葡萄柚種植區(qū)栽培微環(huán)境，對葡萄柚果實、葉片和根際土壤進(jìn)行酵母菌的分離、鑒定，并采用離體、活體試驗方法篩選出對葡萄柚青霉屬致病菌有較好抑菌效果的拮抗酵母菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酵母菌樣本來源 在昆明市西南林業(yè)大學(xué)大棚種植基地和普文種植基地，分別采集健康葡萄柚的果實、葉片和根際土壤樣品，用于酵母菌的分離。每個樣品采集3份，用無菌自封袋分裝，并于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 病原菌來源 病原菌來源于發(fā)病腐爛葡萄柚和金柑。其中，Penicilliumdaejeonium、Penicilliumcrustosum來自發(fā)病葡萄柚果實，Penicilliumdigitatum來自發(fā)病金柑。經(jīng)活體驗證，3株病原菌均為葡萄柚致腐菌。

1.1.3 培養(yǎng)基 YM培養(yǎng)基(麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基)[17]：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，酵母粉3 g，麥芽提取物3 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH值調(diào)至6.2。121 ℃滅菌30 min。

PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基)[18]：土豆200 g，葡萄糖(蔗糖)20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH值不調(diào)整。121 ℃滅菌30 min。

1.1.4 葡萄柚果實 活體試驗的果實購于佳沃(青島)果業(yè)有限公司，品種為“里約紅”葡萄柚。從中挑選無機(jī)械損傷、無病蟲害、大小均勻、成熟度較一致的果實作為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分離純化 果實及葉片樣品酵母菌株的分離：將健康葡萄柚的果皮或葉片(20 g)分別裝于300 mL無菌燒杯中，加入PBS緩沖液150 mL，將其放在100 r·min-1搖床上，震蕩30 min。在無菌操作臺內(nèi)取出果實和葉片，用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，選取10-1、10-2兩個梯度，分別各取200 μL涂布于YM培養(yǎng)基，每個樣品重復(fù)3次。在28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，觀察菌株生長情況，挑取形態(tài)差異明顯的單個菌落，利用平板劃線法純化后保存?zhèn)溆肹8]。

根際土壤樣品酵母菌株的分離：稱取10 g土壤樣品，放入裝有玻璃珠的250 mL三角瓶中，再加入無菌水90 mL，在搖床上以200 r·min-1的速度振蕩30 min，制成初始土壤懸浮液。在無菌操作環(huán)境下用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，選取10-2、10-3、10-4三個梯度，分別各取200 μL涂布于YM培養(yǎng)基。每個梯度做3次重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察菌株生長情況，挑取形態(tài)差異明顯的單個菌落，利用平板劃線法純化后保存?zhèn)溆肹8]。

1.2.2 酵母菌的鑒定 供試菌株菌落和顯微形態(tài)特征：觀察分離供試菌株在YM培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)特征，并利用普通光學(xué)顯微鏡在40倍鏡下觀察分離菌株的顯微形態(tài)，對分離菌株進(jìn)行初步鑒定。

供試菌株ITS及LSU序列測定及同源性比對：供試菌株DNA的提取，參照生工Ezup柱式真菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行[19]，然后分別利用ITS及NL通用引物進(jìn)行ITS及LSU序列擴(kuò)增[20-22]。引物序列為ITS1: 5’-GTCGTAACAAGGTTAACCTGCGG-3’, ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；NL1：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，NL4：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：2×Taq Master Mix 25 μL，ddH2O 20 μL，引物ITS1、ITS4各1.5 μL(或NL1、NL4各1.5 μL)，DNA 2 μL[12,23]。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存[24]。PCR產(chǎn)物純化后，送昆明擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序。測序所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中與已知序列進(jìn)行BLAST比對分析，并利用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.3 離體抑菌篩選 將分離篩選得到的3株葡萄柚病原菌，分別接種到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d備用。另外，將酵母菌接種到Y(jié)M培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，收集菌體，用血球計數(shù)板配制成107CFU/mL的酵母菌菌懸液。 采用平板對峙法[25]，通過離體抑菌對分離得到的酵母菌進(jìn)行抑菌篩選，初步篩選出對病原菌有較好抑菌效果的拮抗酵母菌。具體方法為：在PDA培養(yǎng)基中間放置一個直徑6 mm的病原菌菌餅，同時在距其邊緣3 cm的4個正十字位置上均勻放置濾紙片，每點濾紙片上加入5 μL酵母菌菌懸液,對照組4個點為相同量的無菌水，每個處理3個重復(fù)；25 ℃恒溫培養(yǎng)2 d后開始觀察抑菌效果，定期記錄病原菌直徑，計算抑菌率。抑菌率=[(對照病原菌直徑-處理病原菌直徑)/對照病原菌直徑]×100%[26]。

1.2.4 活體抑菌效果 選取健康、完好的成熟期葡萄柚果實，在無菌環(huán)境下先用無菌水將其表面灰塵等附著物沖洗干凈，再用75%酒精擦拭果面，晾干。用滅菌竹簽在葡萄柚果實赤道面均勻扎4個孔(5 mm ×5 mm)，每孔接種20 μL配置好的拮抗酵母菌菌懸液(107CFU/mL)，以無菌水為對照。室溫放置2 h，等孔晾干后，接種等量的病原菌菌懸液(105CFU/mL)。后將葡萄柚果實用無菌自封袋單果包裝，置于室溫條件下，每隔12 h定期觀察果實發(fā)病情況，記錄果實病斑直徑，計算果實的發(fā)病率及病斑抑制率。每8次重復(fù)處理為一個處理組(每個處理組2個果實)，重復(fù)3個處理組。果實病斑抑制率=[(對照病斑直徑-處理病斑直徑)/對照病斑直徑]×100%；果實發(fā)病率=(發(fā)病接種數(shù)/總接種數(shù))×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及圖表制作采用Excel 2010軟件，數(shù)據(jù)顯著性分析采用SPSS Statistics 17.0進(jìn)行Duncan’s多重差異顯著性分析以及進(jìn)行獨立樣本T檢驗，差異顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離鑒定

經(jīng)菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察，共得到5株酵母菌。其中，菌株YY(1)、YY(2)分離于西南林業(yè)大學(xué)大棚種植基地的葡萄柚葉片，菌株nf(1)、nf(2)、nf(3)分離于普文種植基地健康葡萄柚的果實。各菌株的形態(tài)特征見圖1和表1。

表1 試驗分離所得5株酵母菌的形態(tài)特征

圖1 試驗分離所得5株酵母菌的菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)特征

在根據(jù)ITS和LSU序列分別構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖2)中，菌株YY(1)均與Pseudozyma聚在一起，屬于Pseudozyma屬，且與菌株P(guān)seudozymafusiformataAP6的序列相似性為100%；菌株YY(2)和nf(2)均與Meira聚在一起，ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹中與菌株MeiranashicolaCBS117161的序列相似性最高，分別為99.5%和99.3%，LSU序列系統(tǒng)發(fā)育樹中均為100%；菌株nf(1)與Moesziomyces均聚在一起，與菌株MoesziomycesantarcticusMAFF307206的序列相似性最高，分別為100%和99.8%；菌株nf(3)均與Kwoniella聚在一起，與菌株KwoniellamangrovensisCBS8507的序列相似性最高，分別為98.6%和99.8%。一般認(rèn)為，供試菌株的rRNA序列的序列相似性在95%～99%屬于相同的屬，序列相似性99%～100%屬于同一菌種[27-29]。由此判斷，分離所得酵母菌株YY(1)為Pseudozymafusiformata，nf(1)為Moesziomycesantarcticus，nf(3)為Kwoniellamangroviensis，YY(2)和nf(2)屬于同一個種Meiranashicola。

圖2 試驗分離所得5株酵母菌基于ITS序列(A)和LSU(B)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 酵母菌對病原菌的離體抑菌效果

經(jīng)離體抑菌試驗發(fā)現(xiàn)，5株酵母菌對病原菌P.digitatum、P.crustosum和P.daejeonium均有一定的抑制效果。菌株YY(1)、nf(1)對3株病原菌的抑菌效果較好。菌株YY(1)對3株病原菌的抑菌率會隨著時間的延長而逐漸增加，而菌株nf(1)對3株病原菌的抑菌效果隨著時間的延長沒有顯著差別。在第8 d時，酵母菌株YY(1)對病原菌P.digitatum、P.daejeonium的抑菌率分別達(dá)到55.20%、59.00%，明顯高于其他酵母菌株(見表2)。

2.3 酵母菌對病原菌的活體抑菌效果

選擇離體抑菌效果好的菌株YY(1)和nf(1)進(jìn)行活體抑菌試驗。結(jié)果表明，YY(1)和nf(1)可以不同程度地降低3株青霉病原菌在果實上的發(fā)病率，抑制果實病斑直徑增長。其中，YY(1)對病原菌P.digitatum和P.daejeonium的抑菌效果最好，nf(1)的抑菌效果次之；而YY(1)和nf(1)對病原菌P.crustosum的抑菌效果沒有明顯差別(見圖3、表3和表4)。

表2 5株酵母菌對3株青霉病原菌的離體抑菌率比較 %

注：JJ-1: P. digitatum; YZ-2:P. crustosum; YZ-3: P.daejeonium。

表3 2株酵母菌YY(1)和nf(1)對3株青霉病原菌活體抑菌后的發(fā)病率 %

表4 2株酵母菌YY(1)和nf(1)對3株青霉病原菌在果實上病斑的抑制率 %

3 討論與結(jié)論

葡萄柚采后在貯藏、運(yùn)輸、銷售過程中，各種病原菌極易通過傷口侵入果實，引起果實腐爛[9]。青霉菌是導(dǎo)致柑桔類果實采后腐爛的主要病原菌，也是葡萄柚采后腐爛的主要病原菌。采后葡萄柚果實營養(yǎng)物質(zhì)和含水量高，pH值低，適宜青霉菌的生長[30]。針對傳統(tǒng)病害防治方法的缺點和不足，拮抗酵母菌具有高效、廉價、安全、環(huán)保等優(yōu)點，逐漸成為采后病害防治的研究熱點[31]。如：Wilson等[32]研究了兩株酵母菌(Debaryomyceshansenii、Aureobasidiumpullulans)對柑桔采后青霉腐爛病的防治效果，結(jié)果表明，兩株酵母菌對青霉病均有一定的抑菌效果。耿鵬[24]從水果樣品上分離得到一株馬克斯克魯維酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)，通過離體和活體抑菌試驗表明，不同濃度的酵母菌懸液對柑桔綠霉病均有一定的防治效果。類似的研究中，Droby等[33]從葡萄柚表面分離得到4株酵母菌：清酒假絲酵母、假絲酵母、嗜油性假絲酵母和漢森氏假絲酵母。其中，假絲酵母對指狀青霉(P.digitatum)的抑菌效果最好。Liu等[23]對重慶北碚地區(qū)柑桔園柑桔果實、葉片和土壤表面進(jìn)行酵母菌的分離、鑒定，通過離體抑菌試驗表明，酵母菌Metschnikowiasp. FL02接種后第7 d完全抑制了P.digitatum的生長。

本研究對葡萄柚果實、葉片和根際土壤進(jìn)行酵母菌的分離和鑒定，獲得5株酵母菌：分離于西南林業(yè)大學(xué)大棚種植基地的葡萄柚葉片的YY(1)、YY(2)，以及分離于普文種植基地健康葡萄柚果實的nf(1)、nf(2)、nf(3)。通過形態(tài)學(xué)和ITS、LSU分子生物學(xué)鑒定，YY(1)為Pseudozymafusiformata，YY(2)和nf(2)為Meiranashicola，nf(1)為Moesziomycesantarcticus，nf(3)為Kwoniellamangroviensis?；铙w抑菌試驗結(jié)果表明，拮抗酵母菌YY(1)和nf(1)對病原菌P.digitatum、P.daejeonium均有較好的抑菌效果，可以降低果實的發(fā)病率，抑制果實病斑的發(fā)展。其中，YY(1)的抑菌效果最好，值得進(jìn)一步用于青霉致病菌的防控試驗。