張春紅，黃正金，樊蘇帆，閭連飛，李維林，吳文龍

(1 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，南京，210014； 2 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南京，210037)

藍(lán)莓(Vacciniumspp.)為杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬(Vaccinium)灌木特色小漿果果樹[1]，其果實因具有豐富的花青素、黃酮及其他酚類物質(zhì)而可以改善視力、提供抗癌物質(zhì)及減輕心臟病風(fēng)險等[2]，近年來被認(rèn)為是最富有綜合價值的漿果之一[3]。藍(lán)莓基因組研究總體仍較落后，加上育種周期長，分子標(biāo)記在遺傳育種上的應(yīng)用仍處于起步階段。SSR(Simple Sequence Repeats)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種新型DNA標(biāo)記，多態(tài)性豐富且呈共顯性，已被廣泛用于多種果樹品種鑒定、種質(zhì)資源研究、遺傳圖譜構(gòu)建及標(biāo)記輔助選擇等[4]，其中種質(zhì)遺傳多樣性鑒定是資源創(chuàng)新利用的關(guān)鍵基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。越桔屬植物種質(zhì)資源豐富，根據(jù)藍(lán)莓長勢特點和生物生態(tài)學(xué)特性，藍(lán)莓種群劃分為 3 個栽培類型，包括高叢藍(lán)莓、矮叢藍(lán)莓及兔眼藍(lán)莓，其中高叢藍(lán)莓又分為北高叢藍(lán)莓、南高叢藍(lán)莓和半高叢藍(lán)莓[5-6]。目前國內(nèi)外已有利用EST-SSR和基因組SSR進(jìn)行越桔屬野生和栽培資源遺傳樣性分析的報道[7]。近年來，不僅有國外學(xué)者利用EST-SSR引物進(jìn)行了藍(lán)莓品種種質(zhì)的遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)分析[8]，也有用其分析野生和栽培種的遺傳多樣性的研究[9]。崔建明等[10]和孫英新等[11]分別利用SSR和EST-SSR引物對越桔屬種質(zhì)資源進(jìn)行了分析，揭示了不同種質(zhì)資源的遺傳狹窄，需加強(qiáng)野生資源和種間資源的利用。近年來，盡管利用不同分子標(biāo)記技術(shù)開展藍(lán)莓遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析和品種鑒定已經(jīng)取得很多進(jìn)展，但與其他園藝作物相比，SSR標(biāo)記在藍(lán)莓上的應(yīng)用研究還有很大的空間[12]。

目前商業(yè)化栽培的高叢、矮叢和兔眼藍(lán)莓，因需冷量差異及不斷的漸滲雜交和染色體多倍性等原因[13]，使得品種遺傳背景較為復(fù)雜，生產(chǎn)上品種的選育也多源于種間雜交。不同類型的藍(lán)莓其選育目標(biāo)不同，因此應(yīng)對染色體數(shù)目相同種的不同遺傳基礎(chǔ)進(jìn)行詳盡揭示。為了合理利用藍(lán)莓品種資源，選育適于南方氣候類型的高叢和兔眼藍(lán)莓品種，有必要利用現(xiàn)代分子標(biāo)記手段對其遺傳變異基礎(chǔ)進(jìn)行解析。本研究即基于文獻(xiàn)已報道EST-SSR和SSR分子標(biāo)記信息，利用多態(tài)性好的標(biāo)記對目前主栽的高叢和兔眼藍(lán)莓品種間的遺傳多樣性進(jìn)行分析，以期為品種鑒定和利用、雜交組合配制和雜交育種親本選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

供試材料為國外引進(jìn)和自主選育的品種品系66份，其中包括19份兔眼藍(lán)莓(R)，19份北高叢藍(lán)莓(NHB)，28份南高叢藍(lán)莓(SHB)，均種植于江蘇南京溧水白馬科學(xué)基地，各種質(zhì)的名稱、類型及系譜等信息見表1。采集各種質(zhì)的幼嫩葉片，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取

參照Takara植物DNA提取試劑盒(Code D9194)的說明書提取藍(lán)莓基因組DNA，之后再用0.8%瓊脂糖凝膠電泳法檢測其質(zhì)量。

1.3 SSR序列的設(shè)計及合成

藍(lán)莓SSR和EST-SSR序列來源于文獻(xiàn)中報道的藍(lán)莓分子標(biāo)記[7，14]。初步設(shè)計了56對序列引物，將其編號為Vc1～Vc56(見表2)。引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

1.4 SSR引物的擴(kuò)增篩選

利用上述SSR和EST-SSR引物，擴(kuò)增不同藍(lán)莓種質(zhì)的基因組DNA，進(jìn)行各引物最適溫度的篩選。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積為20 μL，其中包括1 μL 50 ng模板DNA、10 μL 的2×Taq PCR Master Mix(上海浦迪生物科技有限公司)、上游和下游引物10 μmol/L各1 μL，7 μL的ddH2O。94 ℃預(yù)變性5 min， 30個擴(kuò)增循環(huán)，每個循環(huán)包括94 ℃變性30 s，復(fù)性(45～60 ℃)30 s，72 ℃延伸 30 s，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)在ABI Veriti96 PCR儀上進(jìn)行。采用8%的非變性聚丙烯酰胺進(jìn)行PCR產(chǎn)物的電泳，150 V穩(wěn)壓電泳120 min。電泳結(jié)束后，用0.2% AgNO3染色后置于燈箱上拍照。將多態(tài)性好的引物對用于各種質(zhì)基因組DNA的PCR擴(kuò)增，根據(jù)條帶擴(kuò)增情況統(tǒng)計和分析。

1.5 SSR引物在藍(lán)莓品種遺傳多樣性分析中的應(yīng)用

將篩選到的多態(tài)性穩(wěn)定的引物記錄帶型，將有條帶的標(biāo)記為帶型“1”，無法正確辨別帶型的以“0”表示，用于后續(xù)遺傳多樣性分析。通過分析帶型，比較品種間多態(tài)性位點的差異，確定引物的多態(tài)率及多態(tài)信息量。使用NTSYS-pc Ver.2.10e軟件進(jìn)行UPGMA聚類分析，使用Picalc 0.6軟件計算各引物的PIC值。

表1 藍(lán)莓66份種質(zhì)名稱、類型及系譜信息

續(xù)表1

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物多態(tài)性篩選

對56對SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，篩選引物適合溫度及檢測目的條帶情況，所有引物均可以擴(kuò)增出符合預(yù)期大小的條帶。其中多態(tài)較好的引物為25對(見表2)，占引物數(shù)的44.64%，將其進(jìn)一步用于藍(lán)莓種質(zhì)的遺傳多樣性分析。

2.2 多態(tài)性引物的擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性

25對多態(tài)性引物中，多數(shù)引物擴(kuò)增的位點數(shù)為5～7。25對多態(tài)性引物在66份藍(lán)莓中檢測到165個等位基因變異，平均每個SSR位點有6.6個，變幅為3～15個。多態(tài)性信息含量(PIC)為0.656～0.947，平均值為0.777。這些引物基本上能有效地檢測出不同品種間材料的SSR差異位點，具有較高的遺傳多樣性。

基于遺傳相似系數(shù)利用UPGMA法對66份藍(lán)莓進(jìn)行聚類分析，遺傳相似系數(shù)為0.60～0.96。不同藍(lán)莓品種明顯按各自類型聚為3類，I、II和III類分別為兔眼藍(lán)莓、北高叢藍(lán)莓和南高叢藍(lán)莓。兔眼藍(lán)莓“紅粉佳人”不同于一般的兔眼品種類型，而和南高叢藍(lán)莓距離似乎更近，反映出該品種可能具有一些高叢藍(lán)莓品種的遺傳種質(zhì)成分(見圖1)。

從更細(xì)致地劃分來看，第I類群19個兔眼藍(lán)莓的遺傳相似系數(shù)為0.62～0.96，巴爾德溫、燦爛、昂絲羅、粉藍(lán)、梯芙藍(lán)和杰兔等6個品種似乎距離更近，推測與其系譜中均具有梯芙藍(lán)種質(zhì)成分有關(guān)。博尼塔、沃農(nóng)、烏達(dá)德、精華、布萊特藍(lán)距離較近，與其均具有“Callaway”種質(zhì)成分有關(guān)。巨豐、巨藍(lán)、頂峰、森吐里昂關(guān)系較為密切，也暗示其具有比較相似或接近的遺傳種質(zhì)成分。園藍(lán)和“紅粉佳人”品種則與其他兔眼藍(lán)莓關(guān)系較遠(yuǎn)。第II類群19個北高叢品種的遺傳相似系數(shù)為0.71～0.87，又細(xì)分為4個小的類群，甜心、藍(lán)金、綠寶石和瑞卡關(guān)系較為密切，藍(lán)港、斯巴坦、丹尼斯藍(lán)距離較近，瑞貝爾、奧羅拉和公爵親緣關(guān)系更近，其余9個品種距離似乎更近。第III類群28個南高叢品種的遺傳相似系數(shù)為0.62～0.92，從分類上近乎可以分為3個小的類群，天后、珠寶、陽光藍(lán)和玉藍(lán)親緣關(guān)系較近，海岸、頂級、庫珀、奧尼爾、明星、奧扎克藍(lán)、安娜幾個品種距離更近。其余17個品種明顯聚為一類，其中自主選育的寨選3號、4號、5號、7號、8號和9號與大果藍(lán)金親緣關(guān)系最近，推測其之間可能存在相似的遺傳種質(zhì)成分。

25對多態(tài)性引物中，多態(tài)性最高的Vc26可檢測到15個等位基因數(shù)目(見表2、圖2)，其次是Vc42和Vc13，分別可以檢測到13和10個等位基因數(shù)目(見表2)。Vc25、Vc36、Vc49、Vc56分別可以檢測到6、9、8、5個等位基因數(shù)目，擴(kuò)增所示見圖2，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，且在不同類型藍(lán)莓種質(zhì)中區(qū)別明顯，或可以用于不同材料的區(qū)分。

表2 藍(lán)莓多態(tài)性SSR引物序列及檢測多態(tài)性情況

續(xù)表2

圖1 基于遺傳相似系數(shù)的66份藍(lán)莓品種聚類分析

注：5對多態(tài)引物Vc26、Vc25、Vc36、Vc49和Vc56分別能檢測出15、6、9、8、5個等位基因位點類型； 編號R1～R19、N1～N19、 S1～S28分別對應(yīng)表1中的品種編號。M為50 bp DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論與討論

藍(lán)莓起源于北美，于20世紀(jì)80年代引進(jìn)我國，隨著大面積推廣種植，藍(lán)莓栽培面積穩(wěn)步增加，發(fā)展區(qū)域由東北地區(qū)到長江流域均有種植，具有巨大的市場前景。目前我國藍(lán)莓育種研究總體尚處于引種和繁育推廣階段，自育品種少，隨著生產(chǎn)中引進(jìn)品種退化問題逐漸顯現(xiàn)，加上國內(nèi)檢疫和國外對于品種知識產(chǎn)權(quán)的保護(hù)使得引種受限，加強(qiáng)現(xiàn)有藍(lán)莓種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)解析加以育種利用迫在眉睫。利用多種類型分子標(biāo)記開展藍(lán)莓種質(zhì)遺傳多樣性分析的研究均有一定的報道[12]，其中SSR標(biāo)記被認(rèn)為是可用于評價不同類型藍(lán)莓遺傳基礎(chǔ)的有效方法[9]。本研究基于目前南方地區(qū)生產(chǎn)上種植應(yīng)用的高叢和兔眼藍(lán)莓種質(zhì)，利用多態(tài)性較好的SSR和EST-SSR標(biāo)記揭示其遺傳基礎(chǔ)，以期用于輔助育種，發(fā)掘更多有價值的種質(zhì)資源的信息。

本研究利用25對具有多態(tài)性的引物對66份藍(lán)莓種質(zhì)資源進(jìn)行了鑒定，多態(tài)性信息含量PIC平均值達(dá)0.777，表明這些引物的擴(kuò)增產(chǎn)物具有豐富的多態(tài)性，可以有效用于這些種質(zhì)的親緣關(guān)系分析?；诒备邊?、南高叢和兔眼藍(lán)莓3種類型聚類分析的結(jié)果，遺傳相似系數(shù)為0.60～0.96，不同類型之間分類明顯，不同類型內(nèi)亞群的距離遠(yuǎn)近與其系譜信息有著一定的關(guān)聯(lián)性。由聚類分析的結(jié)果推測不同類型種質(zhì)可能具有不同倍性，兔眼藍(lán)莓多為六倍體，與四倍體和二倍體種質(zhì)具有較遠(yuǎn)的遺傳距離[14-15]。兔眼藍(lán)莓“粉紅佳人”雖然系譜中含有巨豐的遺傳成分，但兩者并未聚到一起，推測與可能有其他遺傳成分占優(yōu)勢有關(guān)，其聚于兔眼和北高叢品種類型之間，反映出該品種可能也具有一些高叢藍(lán)莓品種的遺傳種質(zhì)成分。從聚類圖看，盡管南高叢藍(lán)莓從兔眼和北高叢藍(lán)莓中衍生而來，南高叢與兔眼藍(lán)莓的距離似乎遠(yuǎn)于南高叢和北高叢，究其原因可能在于選用的分子標(biāo)記多來源于北高叢藍(lán)莓或南高叢品種的基因組重組傾向于形成四倍體[14]?？傮w上，19個兔眼藍(lán)莓依據(jù)遺傳相似系數(shù)0.62～0.96分為4個不同的小類群，19個北高叢藍(lán)莓根據(jù)相似系數(shù)0.71～0.87分為5個小類群，28個南高叢藍(lán)莓根據(jù)遺傳相似系數(shù)0.62～0.92分為3個小的類群，不同種質(zhì)之間親緣關(guān)系較近的明顯距離較近。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)有9個品種尚未查詢到系譜信息，這些品種的遺傳種質(zhì)成分或與其他品種的親緣關(guān)系或可以根據(jù)其在聚類圖中的位置進(jìn)行推測，如北高叢類型的甜心與藍(lán)金距離較近，圣藍(lán)與錢德勒距離較近，南高叢類型的天后與珠寶距離較近，安娜與奧扎克藍(lán)距離較近，追雪和春高與薄霧較近，脆藍(lán)、卡米爾和溫莎三者距離最近。筆者自主選育的寨選3、4、5、7、8、9號品種相距較近，且與大果藍(lán)金相距最近，證實了其均是大果藍(lán)金的自選系后代。

SSR標(biāo)記為藍(lán)莓種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析及遺傳圖譜構(gòu)建提供了快速可靠的手段，越來越多優(yōu)良標(biāo)記的發(fā)掘為越桔屬基因組和藍(lán)莓育種研究提供了有價值的線索[16]。本研究篩選出了多態(tài)性較好的25對SSR引物，利用其多態(tài)性揭示了3種不同類型藍(lán)莓栽培種質(zhì)的差異，研究結(jié)果不僅為藍(lán)莓品種鑒定提供了引物選擇，也有利于不同種質(zhì)的遺傳研究和在育種中的利用。本研究分析發(fā)現(xiàn)，目前引種藍(lán)莓種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)相對較窄，雜交育種中應(yīng)拓寬親本來源和加強(qiáng)野生資源的收集利用，這對今后雜交育種中親本的選用具有一定借鑒意義。