王宏波，楊冬梨，徐宗佩，李玉紅

天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193

阿霉素（doxorubicin，DOX）屬于第二代蒽環(huán)類高效廣譜抗腫瘤抗生素，臨床廣泛應(yīng)用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體腫瘤的治療［1-3］，但因其出現(xiàn)的劑量依賴性心臟毒性，限制了其臨床應(yīng)用［4-5］。研究表明，線粒體是DOX心臟損傷最主要的細(xì)胞器，DOX誘導(dǎo)的心臟功能紊亂主要是線粒體損傷和功能障礙［6］。作為許多生理生化過程必不可少的場所，如氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)、脂肪酸的β-氧化、鈣處理和血紅素生物合成等，線粒體在細(xì)胞代謝中起著中心調(diào)節(jié)的作用［7］。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）開放被認(rèn)為是造成DOX心肌線粒體損傷的決定因素［8］。以抑制mPTP開放，降低線粒體腫脹為主的線粒體途徑干預(yù)DOX心臟毒性成為心肌保護(hù)藥物的研究熱點(diǎn)。

參附注射液（shenfu injection，SFI）源自《校注婦人良方》之參附湯，由紅參和黑附片提取物制成，主要含有人參皂苷和烏頭類生物堿［9］，具有益氣固脫、振奮心陽之功效，是心血管系統(tǒng)疾病的臨床常用藥物，具有很好的心肌保護(hù)作用［10-15］。臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究［16-17］均表明，SFI能改善腫瘤患者放化療后的生活質(zhì)量，減輕阿霉素的心臟損傷但不降低其療效，常作為腫瘤患者放化療后的輔助用藥［18-19］。本實(shí)驗(yàn)采用皮下注射DOX誘導(dǎo)大鼠心肌損傷，旨在觀察SFI是否能通過改善心肌線粒體呼吸功能障礙，減輕DOX的心臟損傷，從線粒體角度探討其潛在的機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物清潔級健康SD雄性大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量為220～240 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證編號：SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，室溫20～25℃，相對濕度40% ～60%，并以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心標(biāo)準(zhǔn)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。動(dòng)物倫理審核編號：TCM-LAEC2019042。

1.2 藥物與試劑SFI（雅安三九藥業(yè)有限公司，批號：20043116）；阿霉素（深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號：H44024359）；9 g·L-1氯化鈉注射液（中國大冢制藥有限公司，批號：20181206）。

1.3 儀器Oxygraph-2k型線粒體呼吸測量儀（奧地利Oroboros公司）；INFINITEF50型多功能讀板機(jī)（瑞士TECAN公司）；JA1003型電子分析天平（上海天平儀器）；臺式冷凍離心機(jī)（美國Thermo公司）；DW-86L38型立式超低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司）；Vevo2100TM型超高分辨率小動(dòng)物超聲實(shí)時(shí)影像系統(tǒng)（加拿大Visual Sonics公司）。

2 方法

2.1 造模及給藥方法SD雄性大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為空白（SAL）組、空白參附（SAL+SFI，5 mL·kg-1）組、模型（DOX）組、參附高劑量（DOX+SFI，5 mL·kg-1）組、參附低劑量（DOX+SFI，1 mL·kg-1）組。DOX組及DOX+SFI組給予皮下注射阿霉素（2 mg·kg-1），每周1次，共7周，建立心臟損傷模型［20-21］。停止注射DOX后1周處死動(dòng)物。SAL組給予等容積的無菌生理鹽水，加用SFI組在DOX損傷前一天開始腹腔注射SFI，持續(xù)給藥5 d，大鼠在造模和給藥過程中均未出現(xiàn)死亡，確保每組最終大鼠數(shù)量12只。

2.2 心臟生化指標(biāo)的檢測最后一次給予阿霉素或生理鹽水后第7天，麻醉大鼠，仰臥體位，快速打開胸腔，取出心臟，沖洗、拭干，稱其體質(zhì)量。分離約20～25 mg的心肌組織，在20 mmol·L-1的Tris／KCl勻漿液中低溫勻漿，3 000 g離心10 min，上清液儲存于-80℃冰箱用于生化檢測。心臟超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）用WST-8法進(jìn)行檢測。

2.3 心臟線粒體的制備采用差速分級離心法分離心肌線粒體。將大鼠心肌組織剪為碎塊放入玻璃勻漿器內(nèi)，加入冰水預(yù)冷的勻漿介質(zhì)，0℃冰浴研磨組織，將組織勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管，1 000×g離心5 min；取上清，1 000×g再次離心5 min；取上清12 000 g離心10 min，線粒體沉淀在管底，棄上清，取沉淀，加入冰水預(yù)冷的store buffer，混懸線粒體，所有離心均在4℃進(jìn)行。用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白含量，制備的線粒體4 h內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。

2.3.1 線粒體呼吸功能的測定使用細(xì)胞呼吸測量儀檢測線粒體呼吸，根據(jù)氧耗曲線，記錄態(tài)Ⅲ和態(tài)Ⅳ呼吸速率，并計(jì)算態(tài)Ⅲ與態(tài)Ⅳ的呼吸速率（nmolO2·min·mg pro-1）之比，即為線粒體呼吸控制率（respiratory control ratio，RCR）。

2.3.2 線粒體腫脹的檢測線粒體腫脹以線粒體在200μmol·L-1的CaCl2作用下腫脹產(chǎn)生的吸光度（A520）變化值表征。取線粒體用線粒體腫脹液稀釋至0.5 g·L-1，在25℃下取200μmol·L-1的CaCl2作用于線粒體，10 min內(nèi)觀察在520 nm處線粒體吸光度的變化值，該變化反映線粒體腫脹程度，提示mPTP的開放情況。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 體質(zhì)量、心臟質(zhì)量及心臟指數(shù)與SAL組比較，DOX組大鼠體質(zhì)量及心臟質(zhì)量明顯降低（P＜0.05），心臟指數(shù)有下降趨勢（P＞0.05）；與DOX組比較，參附高低劑量組大鼠體質(zhì)量、心臟質(zhì)量、心臟指數(shù)有升高趨勢（P＞0.05）。見表1。

表1 SFI對大鼠體質(zhì)量、心臟質(zhì)量及心臟指數(shù)的影響 （±s，n＝12）

表1 SFI對大鼠體質(zhì)量、心臟質(zhì)量及心臟指數(shù)的影響 （±s，n＝12）

注：與SAL組比較，*P＜0.05

組別 體質(zhì)量／g心臟質(zhì)量／g 心臟指數(shù)SAL組514.22±23.59 1.38±0.09 2.68±0.17 SAL+SFI5組 522.22±27.45 1.38±0.07 2.62±0.11 DOX組381.00±13.00* 1.04±0.05* 2.61±0.40 DOX+SFI5組 386.17±24.79 1.10±0.06 2.65±0.26 DOX+SFI1組408.00±25.15 0.97±0.06 2.66±0.33

3.2 線粒體呼吸及腫脹與SAL組比較，DOX組大鼠線粒體態(tài)Ⅲ呼吸速率明顯降低（P＜0.05），心臟線粒體更容易腫脹；與DOX組比較，參附高劑量組大鼠的線粒體態(tài)Ⅲ呼吸速率有升高趨勢，也有降低線粒體腫脹的趨勢（P＞0.05）。SFI對正常大鼠RCR有升高的趨勢，DOX損傷后RCR下降，SFI對DOX造成的RCR下降有一定的改善作用。見表2。

表2 SFI對線粒體呼吸的影響 （±s，n＝12）

表2 SFI對線粒體呼吸的影響 （±s，n＝12）

注：與SAL組比較，*P＜0.05

組別 態(tài)Ⅲ 態(tài)ⅣRCR 腫脹SAL組429.39±115.20 72.16±26.65 4.70±0.71 0.035±0.017 SAL+SFI5組 403.23±187.36 67.93±32.75 5.51±1.82 0.027±0.006 DOX組241.05±80.84* 85.13±36.82 4.29±0.39 0.043±0.014 DOX+SFI5組 300.06±158.70 82.53±29.86 4.74±0.75 0.031±0.009 DOX+SFI1組 226.90±66.80 77.89±50.80 4.81±0.98 0.043±0.018

3.3 SFI對心肌SOD活性的影響與SAL組比較，DOX組大鼠心臟T-SOD、CuZn-SOD、Mn-SOD與SAL組比較，無明顯變化（P＞0.05）；與DOX組比較，DOX+SFI5組心臟CuZn-SOD明顯升高（P＜0.05）。見表3。

表3 SFI對心肌SOD活性的影響 （±s，n＝12）

表3 SFI對心肌SOD活性的影響 （±s，n＝12）

注：與DOX組比較，*P＜0.05

T-SOD CuZn-SOD Mn-SOD SAL組組別15.89±0.87 5.07±0.70 10.82±1.19 SAL+SFI5組16.64±0.83 4.82±1.16 11.75±1.37 DOX組16.85±0.41 5.13±0.71 11.72±0.91 DOX+SFI5組16.55±0.49 6.29±1.48* 10.25±1.43 DOX+SFI1組15.53±1.20 7.42±2.65*8.11±3.24

4 討論

mPTP是存在于線粒體內(nèi)外膜之間的一種非特異性通道，是線粒體內(nèi)外信息交流的重要樞紐。mPTP是由多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，根據(jù)細(xì)胞環(huán)境不同，mPTP有3種開放狀態(tài)：①完全關(guān)閉狀態(tài)，線粒體跨膜電位（△Ψm）穩(wěn)定；②可逆的低水平開放狀態(tài)，僅允許相對分子量小于300Da的物質(zhì)通過，△Ψm可逆性降低；③不可逆的高水平開放狀態(tài)，使相對分子質(zhì)量小于1 500 Da的物質(zhì)通過線粒體內(nèi)膜，△Ψm不可逆的降低［22］。當(dāng)心肌細(xì)胞遭受損傷時(shí)，線粒體mPTP開放是導(dǎo)致線粒體功能障礙、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死的主要因素［23］。眾多研究證實(shí)，mPTP開放引起的線粒體腫脹、破裂是引起心肌缺血再灌注損傷的關(guān)鍵因素，缺血心肌的功能恢復(fù)也與mPTP開放程度相關(guān)，故抑制其開放成為心肌保護(hù)作用的最終效應(yīng)器［24］。

研究表明，DOX誘導(dǎo)的心臟功能紊亂主要與線粒體的損傷及其相關(guān)的氧化損傷和凋亡相關(guān)［25-27］，其心臟毒性的病理生理機(jī)制主要是損傷了線粒體復(fù)合物Ⅰ的氧化還原反應(yīng)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)增加，線粒體呼吸和磷酸化被抑制，干擾了細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)［28］。線粒體鈣超載及氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)mPTP開放的主要因素，而阿霉素造成心臟線粒體氧化應(yīng)激及細(xì)胞內(nèi)鈣紊亂，形成了有利于mPTP開放的條件，最終導(dǎo)致mPTP開放、線粒體損傷。mPTP的開放伴隨著線粒體膜電位降低，線粒體膨脹、外膜破裂和一系列前凋亡因子的釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［23］。有研究報(bào)道，SFI具有降低內(nèi)毒素血癥大鼠腸上皮細(xì)胞線粒體膜電位的作用［29］。RCR是評價(jià)線粒體結(jié)構(gòu)和功能完整性及氧化磷酸化效率的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阿霉素促進(jìn)mPTP的開放導(dǎo)致大鼠心臟線粒體腫脹，抑制大鼠心臟線粒體態(tài)Ⅲ呼吸，降低了RCR。給予SFI后，上述指標(biāo)有一定程度改善，說明SFI具有一定的保護(hù)心肌細(xì)胞線粒體免受阿霉素?fù)p傷的作用。

SOD通過把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫和氧氣，而后在過氧化氫酶和過氧化物酶的作用下將過氧化氫分解為水，從而起到清除自由基的作用。有研究報(bào)道SFI能夠增加大鼠心肌SOD含量、減少丙二醛（malondialdehyde，MAD）含量、抑制蛋白凋亡，從而改善心力衰竭大鼠氧化應(yīng)激水平［30］。亦有研究發(fā)現(xiàn)，SFI可明顯改善阿霉素所致心衰大鼠的心功能，保護(hù)機(jī)制可能與抗氧化及降低血管緊張素Ⅱ的含量有關(guān)［31］。本研究發(fā)現(xiàn)，SFI有升高大鼠心肌CuZn-SOD的趨勢，表明SFI可能通過增強(qiáng)SOD活性而發(fā)揮抗氧化作用起到心臟保護(hù)的作用。

綜上所述，阿霉素抑制了大鼠心肌線粒體呼吸功能，高劑量的SFI可改善阿霉素?fù)p傷大鼠的線粒體腫脹程度，升高CuZn-SOD，但SFI抗阿霉素心臟毒性機(jī)制研究還需要進(jìn)一步探索。