李慧，邢學(xué)勇，王一新，楊爽，趙麗，郭俊華

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng)453000；2.河南大學(xué)，河南 開(kāi)封475000

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種氣流受限、伴有氣道高反應(yīng)性的呼吸道疾病，表現(xiàn)為肺功能下降，對(duì)患者生存質(zhì)量造成嚴(yán)重影響［1］。COPD發(fā)病過(guò)程復(fù)雜，易受環(huán)境有害氣體或顆粒影響而急性發(fā)作，氣道、肺實(shí)質(zhì)等發(fā)生炎癥病變，若不及時(shí)有效干預(yù)則可能造成肺功能持續(xù)下降，導(dǎo)致患者呼吸衰竭而死亡［2-3］。尋找有效治療手段對(duì)COPD急性發(fā)作期的治療有重要意義。COPD中醫(yī)治療日漸受到關(guān)注［4-5］。研究表明，魚腥草具有多種潛在藥用價(jià)值，其提取物中含有多種活性成分且均具有顯著的抗炎作用，與地塞米松抗炎能力相近［6］。目前，魚腥草多用于輔助治療支原體肺炎、支氣管哮喘等肺部炎癥性疾病［7］，但關(guān)于其對(duì)COPD急性加重期炎癥抑制作用及呼吸功能的影響報(bào)道較少。本研究觀察魚腥草提取物對(duì)COPD急性加重期大鼠模型肺功能的影響，并探討其抗炎機(jī)制，以期指導(dǎo)臨床用藥。

1 材料

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)雄性健康Wistar大鼠50只，6周齡，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2017-0007，飼養(yǎng)于12 h／12 h明暗交替，23～25℃，40%～50%濕度下，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2 藥物與試劑魚腥草（北京同仁堂股份有限公司），100 g魚腥草加入3倍體積蒸餾水煎煮兩次，合并兩次煎煮液，蒸發(fā)濃縮至100 mL，有效含量為1 000 g·L-1，使用前用蒸餾水稀釋至相應(yīng)濃度。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（美國(guó) R＆D Systems公 司，批 號(hào) 分 別 為：ML1421、M6000B、MLB00C）；兔抗大鼠Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）、核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）多抗、山羊抗兔單抗（美國(guó)Invitrogen公司，貨號(hào)分別為：48-2300、46-2725、41-3850）；

1.3 儀器AniRes2005型實(shí)驗(yàn)用小動(dòng)物肺功能測(cè)定儀（北京貝蘭博科技有限公司）；QuantStudio 3型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）；CheniDoc XRS型化學(xué)發(fā)光成像分析儀（美國(guó)Bio-rad公司）。

2 方法

2.1 分組與模型建立取50只大鼠，按照體質(zhì)量排序法隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、COPD組、魚腥草低劑量（1.25 g·kg-1）組、魚腥草中劑量（2.50 g·kg-1）組、魚腥草高劑量（5.00 g·kg-1）組，各10只。首先采用煙熏聯(lián)合氣道內(nèi)滴注內(nèi)毒素法建立COPD穩(wěn)定期模型，在此基礎(chǔ)上鼻腔內(nèi)滴菌法建立COPD急性加重期模型［8］，具體操作方法為：分別于實(shí)驗(yàn)第7、14、28天氣管內(nèi)滴入濃度為1 g·L-1的內(nèi)毒素0.2 mL，于實(shí)驗(yàn)第1～28天（第7、14、28天除外）將大鼠放置于容積為72 L的有機(jī)玻璃倉(cāng)內(nèi)，注入雄獅牌香煙煙霧，維持煙霧濃度5%（V／V），每次30 min，建立COPD穩(wěn)定期模型；于第29～32天，鼻腔內(nèi)滴注濃度為2.4×109CFU·mL-1的金黃色葡萄球菌溶液，每次0.3 mL，每天2次，連續(xù)4 d。大鼠表現(xiàn)為呼吸喘促，動(dòng)則加劇，鼻部潮濕，打噴嚏及體溫升高等體征則判定為COPD急性加重期模型建立成功。

2.2 給藥方法除對(duì)照組外，造模大鼠建立COPD急性加重期模型過(guò)程中因氣管插管、麻醉等原因分別死亡2、2、1、1只，其余均建模成功，參與后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。對(duì)照組大鼠氣逍和鼻腔內(nèi)每次滴注等體積生理鹽水。根據(jù)動(dòng)物與人體間的等效劑量換算［9］，計(jì)算大鼠給藥劑量。所有大鼠每天灌胃1次，連續(xù)灌胃4周。

2.3 肺功能指標(biāo)測(cè)定末次灌胃后2 h，各組大鼠用12%的烏拉坦腹腔麻醉，仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)小動(dòng)物肺功能測(cè)定儀的密閉體積掃描箱內(nèi)，大鼠頸部備皮，縱向切開(kāi)皮膚暴露氣管，于第3～4氣管環(huán)中間切倒T型切口，插入氣管插管，插管連接三通開(kāi)關(guān)，一端連接動(dòng)物呼吸機(jī)，先描記一段平靜呼吸，然后由呼吸機(jī)輸入4～6倍潮氣量模擬用力吸氣過(guò)程，測(cè)定用力肺 活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC），再 由25 cm H2O負(fù)壓系統(tǒng)模擬用力呼氣過(guò)程，記錄由胸廓起伏造成容積變化，通過(guò)壓力換能器和放大器信號(hào)處理系統(tǒng)計(jì)算肺功能各項(xiàng)指標(biāo)，包括用力呼氣峰流速（peak expiratory flow rate，PEF）、第0.3秒用力呼氣容積（forced expiratory volume at 0.3 second，F(xiàn)EV0.3）／FVC、最大呼氣中期流速（maximum middle expiratory flow rate，MMEF）［10］。

2.4 肺泡灌洗液（alveolar lavage fluid，BALF）中炎癥因子水平檢測(cè)肺功能指標(biāo)測(cè)定結(jié)束后，處死各組大鼠，于氣管切口處插入氣管套管，用1 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）反復(fù)灌洗3次，收集BALF，2 800 r·min-1離心10 min（離心半徑為10 cm），取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平，按照試劑盒說(shuō)明書執(zhí)行操作。

2.5 肺組織病理學(xué)觀察收集BALF完成后立即打開(kāi)大鼠胸腔，取部分右肺組織，置于4%中性甲醛中固定48 h，然后經(jīng)酒精脫水、石蠟包埋，修整后，采用切片機(jī)制備厚度為4μm的切片，切片進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

2.6 檢測(cè)肺組織中TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)取新鮮右肺組織70 mg，用組織剪剪碎，按照Trizol法提取肺組織中的總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)鏈cDNA，以之為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)，按照試劑盒設(shè)定反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95℃，5 min；94℃，30 s，56℃，30 s，72℃，60 s；重復(fù)40個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。用β-actin基因?yàn)閮?nèi)參對(duì)照，計(jì)算TLR4、NF-κB相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度（2-△△CT）［11］。引物序列：TLR4：F：5′-ACGTGATGCTGTTAACCGT-3′，R：5′-TAGTCGTGAACGTGCGTAC-3′；NF-κB：F：5′-CATCAAGCGTACGTGCGTA-3′，R：5′-CTGATGCGTCTGAGATCTA-3′；β-actin：F：5′-TAACGCCGATGCAATGTCT-3′，R：5′-CATGTGGAACTCTGTGCTC-3′。

2.7 檢測(cè)肺組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)取新鮮右肺組織70 mg于EP管中，加入細(xì)胞裂解液500μL，置于冰上裂解20 min，4℃、12 000 r·min-1離心15 min（離心半徑10 cm），取上清液，BCA蛋白定量后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜2.5 h，經(jīng)封閉液封閉，按比例稀釋一抗4℃搖床孵育過(guò)夜，按比例稀釋二抗常溫孵育2 h后進(jìn)行曝光和顯影，掃描拍照后，應(yīng)用BandScan軟件進(jìn)行灰度值分析，相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度用TLR4、NF-κB與內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本組間比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠建模情況及一般體征觀察對(duì)照組大鼠營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、飲食、體溫等均正常，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均未死亡。各造模組大鼠COPD穩(wěn)定期出現(xiàn)皮毛暗淡、蜷縮少動(dòng)、呼吸喘促、動(dòng)則加劇現(xiàn)象，經(jīng)鼻反復(fù)滴注菌液期間上述現(xiàn)象更為嚴(yán)重，逐步出現(xiàn)鼻部潮濕、打噴嚏、體溫升高等現(xiàn)象，給藥后上述癥狀得以好轉(zhuǎn)。COPD組、魚腥草（低、中、高劑量）組模型制備成功分別有8、8、9、9只大鼠，參與后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 對(duì)肺功能指標(biāo)的影響與對(duì)照組比較，COPD組、魚腥草（低、中、高劑量）組上述肺功能指標(biāo)均降低（P＜0.05）；與COPD組比較，魚腥草（低、中、高劑量）組上述肺功能指標(biāo)均升高（P＜0.05），其中魚腥草高劑量組高于魚腥草低、中劑量組（P＜0.05），魚腥草低劑量組與魚腥草中劑量組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

3.3 對(duì)BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響與對(duì)照組比較，COPD組、魚腥草（低、中、高劑量）組大鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均升高（P＜0.05）；與COPD組比較，魚腥草（低、中、高劑量）組上述上述炎癥因子水平均降低（P＜0.05），其中魚腥草高劑量組低于魚腥草低、中劑量組，魚腥草中劑量組低于低劑量組（P＜0.05）。見(jiàn) 表2。

表1 肺功能指標(biāo)比較 （±s）

注：與對(duì)照組比較，a P＜0.05；與COPD組比較，b P＜0.05；與魚腥草低劑量組比較，c P＜0.05；與魚腥草中劑量組比較，d P＜0.05

組別n FVC（V／mL）PEF／mL·s-1 FEV0.3／FVC／%MMEF／mL·s-1.05±2.01 COPD組8 5.50±0.53a 29.82±3.02a 67.23±4.02a 16.64±1.12a魚腥草低劑量組8 6.08±0.51ab 36.30±4.37ab 73.65±4.19ab 18.32±1.43ab魚腥草中劑量組9 6.29±0.54ab 39.14±5.24ab 74.09±4.25ab 19.15±2.54ab魚腥草高劑量組9 7.18±0.59abcd 50.36±3.94abcd 78.11±5.07abcd 22.30±2.62abcd F值20.238 62.955 10.949 15.261 P值對(duì)照組10 7.71±0.72 57.61±4.45 80.45±5.24 23＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

表2 BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響 （±s，ng·L-1）

表2 BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響 （±s，ng·L-1）

注：與對(duì)照組比較，a P＜0.05；與COPD組比較，b P＜0.05；與魚腥草低劑量組比較，c P＜0.05；與魚腥草中劑量組比較，d P＜0.05

組別n TNF-αIL-6 IL-1 β 10 38.14±4.03 40.75±6.10 28.97±4.26 COPD組8 65.47±5.29a 131.88±12.23a 85.36±6.78a魚腥草低劑量組8 52.11±5.22ab 104.45±11.15ab 70.12±6.04ab魚腥草中劑量組9 46.80±4.08abc 81.11±10.10abc 61.47±6.15abc魚腥草高劑量組9 42.37±4.14abcd 70.92±9.13abcd 52.53±5.38abcd對(duì)照組F值46.664 109.600 122.141 P值＜0.001＜0.001＜0.001

3.4 肺組織病理觀察HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠支氣管、支氣管黏膜、肺泡等結(jié)構(gòu)基本正常；模型組大量肺泡壁斷裂融合為氣腔、肺泡間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管黏膜上皮可見(jiàn)大量杯狀細(xì)胞增生，支氣管管腔狹窄，氣道內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺小動(dòng)脈管壁增厚，周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；魚腥草各劑量組大鼠上述病理改變較模型組均有所減輕，肺泡融合范圍減小，肺間質(zhì)、氣道及肺小動(dòng)脈周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，其中魚腥草高劑量組改善最明顯，但仍存在少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

圖1 肺組織病理切片（HE染色，×200）

3.5 對(duì)肺組織中TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，COPD組、魚腥草（低、中、高劑量）組肺組織中TLR4 mRNA、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05）；與COPD組比較，魚腥草（低、中、高劑量）組肺組織中TLR4 mRNA、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低（P＜0.05），其中魚腥草高劑量組低于魚腥草低中劑量組，魚腥草中劑量組低于魚腥草低劑量組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

3.6 對(duì)肺組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，COPD組、魚腥草（低、中、高劑量）組肺組織中TLR4、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高（P＜0.05）；與COPD組比較，魚腥草（低、中、高劑量）組肺組織中TLR4、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低（P＜0.05），其中魚腥草高劑量組低于魚腥草低、中劑量組，魚腥草中劑量組低于魚腥草低劑量組（P＜0.05）。見(jiàn)表4，圖2。

表3 對(duì)肺組織中TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)的影響 （±s）

表3 對(duì)肺組織中TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)的影響 （±s）

注：與對(duì)照組比較，a P＜0.05；與COPD組比較，b P＜0.05；與魚腥草低劑量組比較，c P＜0.05；與魚腥草中劑量組比較，d P＜0.05

組別n TLR4 NF-κ B對(duì)照組3 0.92±0.12 1.01±0.11 COPD組3 1.87±0.21a 2.15±0.16a魚腥草低劑量組3 1.54±0.23ab 1.87±0.14ab魚腥草中劑量組3 1.32±0.10abc 1.64±0.15abc魚腥草高劑量組3 1.10±0.11abcd 1.30±0.12abcd F值47.910 98.034 P值＜0.001＜0.001

表4 對(duì)肺組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)的影響 （±s）

表4 對(duì)肺組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)的影響 （±s）

注：與對(duì)照組比較，a P＜0.05；與COPD組比較，b P＜0.05；與魚腥草低劑量組比較，c P＜0.05；與魚腥草中劑量組比較，d P＜0.05

組別n TLR4 NF-κ B對(duì)照組3 0.21±0.04 0.30±0.04 COPD組3 1.20±0.10a 1.35±0.11a魚腥草低劑量組3 0.85±0.07ab 1.17±0.10ab魚腥草中劑量組3 0.77±0.06abc 1.05±0.08abc魚腥草高劑量組3 0.40±0.05abcd 0.64±0.07abcd F值312.227 247.215 P值＜0.001＜0.001

圖2 肺組織中TLR4、NF-κB的蛋白表達(dá)

4 討論

COPD病程復(fù)雜，發(fā)病率和死亡率逐年升高，目前已位列世界疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)第5位，且已成為全球性主要致死病因，亟須尋求有效治療手段改善疾病預(yù)后［12-14］。多種因素均可導(dǎo)致COPD患者氣道、肺實(shí)質(zhì)炎癥反應(yīng)進(jìn)行性加重，抑制肺呼吸功能［15-17］。吸煙、感染是導(dǎo)致COPD發(fā)作及加重的主要因素，煙熏聯(lián)合氣道內(nèi)滴注內(nèi)毒素法建立COPD大鼠模型已獲得廣泛認(rèn)可［18-19］。本研究在該方法基礎(chǔ)上經(jīng)鼻滴入金黃色葡萄球菌以獲得COPD急性加重期大鼠模型，大鼠一般體征觀察及肺組織病理改變與臨床表現(xiàn)一致［20］，可用于實(shí)驗(yàn)研究。

肺功能檢查是COPD診療、預(yù)后評(píng)價(jià)的首要指標(biāo)，反應(yīng)肺組織損傷程度。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度魚腥草干預(yù)后，大鼠FVC、PEF、FEV0.3／FVC、MMEF均較COPD組升高，且高劑量組最高，說(shuō)明魚腥草提取物可有效改善COPD急性加重期大鼠肺功能；干預(yù)后BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均降低，且呈劑量依賴性；病理觀察顯示肺泡融合范圍減小，肺間質(zhì)、氣道及肺小動(dòng)脈周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，說(shuō)明魚腥草提取物可有效減輕COPD急性加重期大鼠肺病理?yè)p傷。藥理學(xué)研究表明，魚腥草水煎液具體顯著的體外抑菌作用，可能通過(guò)抑制細(xì)菌生物被膜發(fā)揮抗菌作用［21-22］。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［23］，魚腥草提取物可有效改善支原體肺炎小鼠肺組織病理變化，降低血清γ-干擾素、IL-6水平，與本研究結(jié)果相符，證實(shí)魚腥草有顯著抗炎作用，推測(cè)魚腥草提取物通過(guò)抑制氣道、肺實(shí)質(zhì)內(nèi)的炎癥反應(yīng)，達(dá)到改善肺功能的作用。

TLR4屬于天然免疫受體Toll樣受體家族成員之一，可通過(guò)直接結(jié)合病原體或其產(chǎn)物的特定分子結(jié)構(gòu)，引發(fā)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放［24-27］。NF-κB是TLR4下游信號(hào)通路，TLR4可通過(guò)髓樣分化因子88依賴和非依賴兩種途徑激活NF-κB信號(hào)通路，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)合成和釋放的作用［28-31］。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用不同濃度魚腥草提取物干預(yù)后肺組織中TLR4 mRNA、NF-κB mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均較COPD組降低，其中魚腥草高劑量組降低最顯著，提示魚腥草提取物可能通過(guò)抑制TLR4／NF-κB信號(hào)通路，調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子水平，從而發(fā)揮改善COPD急性加重期大鼠肺功能，減輕肺病理?yè)p傷的作用。

綜上所述，魚腥草提取物可有效改善COPD急性加重期大鼠肺功能，減輕肺病理?yè)p傷，推測(cè)與抑制TLR4／NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。在進(jìn)一步的研究中，應(yīng)重點(diǎn)探討魚腥草提取物能否通過(guò)其他信號(hào)通路發(fā)揮相應(yīng)調(diào)控作用，為魚腥草相關(guān)藥物的研發(fā)和臨床應(yīng)用提供更全面、充分的理論支持。