周麗麗，安吉洋

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450052

腦膠質(zhì)瘤惡性程度高，預后差，抗血管靶向治療是防止其侵襲和進展的重要策略[1]。然而研究[1]表明，抗血管生成治療藥物貝伐珠單抗不能提高膠質(zhì)瘤患者的總體生存率，甚至可能因缺氧等因素加速腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，增強化療抵抗，并在停藥后迅速反彈。血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)是腫瘤細胞的另一種供血途徑，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[2]。自噬在膠質(zhì)瘤VM形成中發(fā)揮重要作用[3]。自噬通過介導血管內(nèi)皮生成因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR-2)活化促進VM的形成[1]，LC3是自噬過程的標志物。Yes相關(guān)蛋白(yes-associated protein,YAP)是Hippo信號通路中最關(guān)鍵的下游效應因子，在包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤中高度表達，并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。本研究以膠質(zhì)瘤細胞為研究對象，以YAP為靶點，通過基因干預和藥物干預方法研究YAP對膠質(zhì)瘤細胞自噬及VM形成的影響，為膠質(zhì)瘤的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1細胞系與主要試劑人腦膠質(zhì)瘤細胞系HS683、H4、U118、U87和U251細胞購自上海中科院細胞庫。維替泊芬(YAP抑制劑)購自Selleck公司，二甲基亞砜(DMSO)、兔抗LC3抗體購自Sigma公司，兔抗YAP抗體購自Cell Signaling Technology公司，兔抗VE-cadherin抗體購自Abcam公司，二抗購自Proteintech公司。

1.2細胞培養(yǎng)和YAP蛋白表達的檢測HS683、H4、U118、U87和U251細胞分別用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基和MEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用Western blot法檢測上述細胞中YAP蛋白的表達：RIPA裂解液提取細胞總蛋白；取50 μg蛋白樣品行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜放入50 g/L脫脂牛奶或牛血清白蛋白中37 ℃封閉1～2 h；加一抗(兔抗YAP抗體，1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜后，將膜與辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h，洗膜后采用化學發(fā)光法顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照后采用Quantity One軟件測定條帶灰度值，目的蛋白的表達水平以目的蛋白條帶和GAPDH條帶灰度值的百分比表示。實驗重復3次。

1.3調(diào)控YAP表達對U87和U251細胞VM形成及LC3、VE-cadherin蛋白表達的影響根據(jù)1.2結(jié)果篩選出YAP高表達的U251細胞系和YAP低表達的U87細胞系，采用慢病毒感染干擾U251細胞系YAP的表達、上調(diào)U87細胞系YAP的表達。具體步驟如下：取對數(shù)生長期的細胞，U87細胞感染YAP過表達慢病毒(Flag標記的LV-YAP，YAP過表達組)和陰性對照慢病毒；U251細胞感染YAP shRNA慢病毒(YAP shRNA組)和陰性對照慢病毒，所用慢病毒均由中國吉凱基因有限公司合成。感染24 h后用含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，并用0.2 mg/L嘌呤霉素篩選細胞。

參照文獻[5]觀察膠質(zhì)瘤細胞VM結(jié)構(gòu)的形成：96孔板用30 μL Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)涂布，37 ℃下聚合1 h后，將篩選出的細胞分別以2×104個/孔的密度接種到基質(zhì)膠表面，孵育24 h。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并計數(shù)管樣結(jié)構(gòu)。實驗重復3次。

收集篩選出的細胞，提取蛋白。按1.2中Western blot法檢測YAP、LC3(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)、VE-cadherin蛋白的表達，其中一抗均按1∶1 000稀釋，二抗均按1∶10 000稀釋。實驗重復3次。

1.4維替泊芬對U87和U251細胞VM形成及YAP、LC3、VE-cadherin蛋白表達的影響U251和U87細胞分別接種于96孔板和6孔板，2×105個/孔，以5 μmol/L(根據(jù)預試驗選擇)維替泊芬處理。另設(shè)溶劑對照組。處理24 h后，96孔板細胞用于在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并計數(shù)管樣結(jié)構(gòu)，6孔板細胞裂解，提取蛋白，采用Western blot法檢測YAP、LC3、VE-cadherin蛋白的表達情況。

1.5統(tǒng)計學處理應用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)。采用兩獨立樣本t檢驗比較YAP shRNA組(U251細胞)、YAP過表達組(U87細胞)與陰性對照組管樣結(jié)構(gòu)數(shù)、YAP蛋白、LC3及VE-cadherin蛋白表達的差異，以及溶劑對照組和維替泊芬組上述指標的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1不同膠質(zhì)瘤細胞系中YAP蛋白的表達YAP在不同膠質(zhì)瘤細胞系中的表達不同，U87細胞中表達最低，U251細胞中表達最高(圖1)。

2.2調(diào)控YAP表達后U251及U87細胞VM形成及LC3、VE-cadherin蛋白表達的變化下調(diào)U251細胞YAP表達后，VM形成減少，LC3、VE-cadherin表達減低；上調(diào)U87細胞YAP表達后，VM形成增多，LC3、VE-cadherin表達增高(圖2、3及表1、2)。

圖1 不同膠質(zhì)瘤細胞系中YAP蛋白的表達

A1、A2：陰性對照組和YAP shRNA組(U251細胞)；B1、B2：陰性對照組和YAP過表達組(U87細胞)

1、2：陰性對照組和YAP shRNA組(U251細胞)；3、4：陰性對照組和YAP過表達組(U87細胞)

表1 YAP干擾對U251細胞VM形成及YAP、LC3、VE-cadherin蛋白表達的影響

表2 YAP過表達對U87細胞VM形成及YAP、LC3、VE-cadherin蛋白表達的影響

2.3維替泊芬對U251和U87細胞VM形成及YAP、LC3、VE-cadherin蛋白表達的影響與溶劑對照組相比，維替泊芬組VM形成減少，YAP表達減低，LC3和VE-cadherin的表達也減低(圖4、5，表3、4)。

A1、A2：分別為溶劑對照組、維替泊芬組(U251細胞)；B1、B2：分別為溶劑對照組、維替泊芬組(U87細胞)

1、2：分別為溶劑對照組、維替泊芬組

表3 維替泊芬對U251細胞VM形成及YAP、LC3、VE-cadherin蛋白表達的影響

表4 維替泊芬對U87細胞VM形成及YAP、LC3、VE-cadherin蛋白表達的影響

3 討論

VM是一種腫瘤組織內(nèi)微環(huán)境結(jié)構(gòu)，腫瘤細胞通過變形、重塑以及相互連接形成管腔樣結(jié)構(gòu)，向組織供應血液[2]。VM陽性的腫瘤一般具有高侵襲性、生長迅速、易轉(zhuǎn)移、預后差等特點[6]。自噬是指細胞處在低氧、營養(yǎng)及生長因子匱乏的環(huán)境時通過降解錯誤折疊的蛋白及受損細胞器以滿足能量需求、維持存活[7-11]。研究[1]發(fā)現(xiàn)自噬可誘導VEGFR-2激活，從而促進膠質(zhì)瘤干細胞形成VM，抑制自噬可以減少貝伐珠單抗誘導的移植膠質(zhì)瘤VM形成。自噬相關(guān)基因Becin1被抑制后，膠質(zhì)瘤細胞VM形成減少[6]。本研究發(fā)現(xiàn)基因及藥物干預YAP后，VM形成和自噬相關(guān)蛋白的表達均有相同的變化趨勢，提示YAP可能通過調(diào)控自噬影響VM形成。研究[7]顯示，YAP/TAZ共轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)肌球蛋白Ⅱ基因的表達和F-actin應激纖維的聚合，從而促進自噬體的形成，細胞對缺氧及低糖耐受，具有更強的增殖活性。在乳腺癌、卵巢癌中均有研究發(fā)現(xiàn)YAP通過誘導自噬促進腫瘤細胞存活及耐藥[8-10]。

YAP是微環(huán)境內(nèi)細胞的壓力感受器，也是Hippo信號通路下游關(guān)鍵的效應因子。YAP功能異常與腫瘤的發(fā)生、細胞增殖、干性維持、侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。近年來的研究[11-14]發(fā)現(xiàn)mTOR、SOX2等多種分子通過維持YAP的功能促進膠質(zhì)瘤進展。Wei等[15]在胰腺導管腺癌中發(fā)現(xiàn)抑制YAP-TEAD復合物后，Ang2、MMP2、VE-cadherin、α-SMA表達降低，VM形成減少。Azad等[16]研究發(fā)現(xiàn)，YAP/TAZ是介導VEGF/VEGFR誘導的血管生成及VM形成的關(guān)鍵分子。YAP 通過調(diào)控Twist 與F-actin 蛋白促進膠質(zhì)瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力[17]。YAP影響了腫瘤增殖、細胞形態(tài)、黏附蛋白、EMT表型等，使腫瘤細胞具備了形成VM的表型特征；YAP 被激活后入核與HIF-1α結(jié)合形成復合物，維持HIF-1α的穩(wěn)定性，并促進其表達與轉(zhuǎn)錄，進一步增強腫瘤細胞形成VM的條件[18]。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)YAP影響了膠質(zhì)瘤細胞VM的形成，其機制可能與調(diào)控自噬有關(guān)。本研究為揭示參與VM形成的信號通路提供了實驗依據(jù)，為膠質(zhì)瘤的抗血管治療提供了新的靶點。