杜健磊,王俊蘋,劉 偉

1)駐馬店市中心醫(yī)院藥學部 河南駐馬店 463000 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院臨床藥學室 河南新鄉(xiāng) 453003

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是多種病因引起的急腹癥，發(fā)病機制復(fù)雜，炎癥介質(zhì)、胰腺腺泡細胞鈣超載等均與其發(fā)病有關(guān)[1-2]。研究[3]表明中藥治療AP療效確切，可降低病死率。黃酮類化合物主要以游離的苷元或糖結(jié)合的苷類形式存在于植物體內(nèi)，黃酮苷元比結(jié)合型糖苷具有更強的抗炎、抗氧化功能[4]。銀杏黃酮苷元(ginkgo flavone aglycone，GA)是銀杏葉提取物中的黃酮苷通過化學修飾去除糖基后獲得的新型物質(zhì)，研究[5]認為GA對腦缺血和動脈粥樣硬化具有較好的防治作用。GA通過NF-κB信號通路減弱心肌缺血再灌注損傷中的細胞凋亡和炎癥反應(yīng)[6]。雙特異性磷酸酶1(dual specificity phosphatase 1，DUSP1)也稱為絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶1(mitogen-activated protein kinase phosphatase 1，MKP1)。研究[7]表明沉默DUSP1可通過激活A(yù)P小鼠血清中的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路來促進促炎細胞因子的釋放[8]。本實驗用雨蛙素刺激大鼠胰腺腺泡AR42J細胞制備AP腺泡模型細胞[8]，觀察GA對AP腺泡細胞炎癥因子分泌和凋亡的影響，探討其機制是否與DUSP1有關(guān)。

1 材料與方法

1.1細胞株與主要試劑大鼠胰腺腺泡細胞株AR42J購自上海圻明生物科技有限公司；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；雨蛙素購自美國Sigma公司；GA由貴州省生化中心何照范教授惠贈；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；ELISA試劑盒購自上海博湖生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自上?？泼羯锟萍加邢薰荆籖IPA蛋白裂解液、BCA試劑盒購自蘇州瑞諾德生物科技有限公司；qRT-PCR檢測試劑盒購自北京綠源伯德生物科技有限公司。兔源Bax、Bcl-2和DUSP1抗體為美國Abcam公司產(chǎn)品。

1.2AP腺泡細胞模型的建立AR42J用含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1次，細胞融合至80%左右進行傳代。取對數(shù)生長期細胞，加入100 nmol/L雨蛙素刺激6 h，細胞凋亡增加及IL-6、TNF-α水平升高表明AP腺泡細胞模型成功建立[9]。

1.3細胞處理與分組①正常培養(yǎng)的AR42J細胞作為空白對照組，按1.2處理的細胞為AP組，以用15、30、60 mg/L GA處理48 h的模型細胞作為GA低、中、高濃度組。②將pcDNA、pcDNA-DUSP1轉(zhuǎn)染至AR42J細胞6 h后，再用100 nmol/L雨蛙素刺激6 h，分別作為AP+pcDNA組、AP+pcDNA-DUSP1組。③將si-NC、si-DUSP1轉(zhuǎn)染至AR42J細胞6 h后，再用100 nmol/L雨蛙素和60 mg/L的GA處理48 h，分別作為AP+GA+si-NC組、AP+GA+si-DUSP1組，另取模型細胞作為AP組，用100 nmol/L雨蛙素和60 mg/L的GA處理48 h的細胞作為AP+GA組。具體轉(zhuǎn)染方法按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明操作。

1.4ELISA法檢測IL-6、TNF-α分泌水平細胞培養(yǎng)48 h后，取培養(yǎng)上清，采用ELISA試劑盒進行IL-6和TNF-α水平檢測。實驗重復(fù)3次。

1.5Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡情況細胞分組處理后用預(yù)冷的PBS漂洗2次，先加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.6Western blot法檢測Bcl-2、Bax、DUSP1蛋白表達收集各組細胞，提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量。取50 μg蛋白樣品于100 g/L的SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用50 g/L的牛血清蛋白封閉1 h。加入一抗(均按照1∶1 000稀釋)4 ℃過夜，TBST洗膜3次；加入二抗室溫培養(yǎng)1 h，再用TBST洗滌3次，加入化學發(fā)光試劑顯影，用Image J軟件分析，用目的蛋白和內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白表達水平。每個蛋白樣品設(shè)3個重復(fù)，實驗重復(fù)3次。

1.7qRT-PCR法檢測DUSP1mRNA的表達提取空白對照組，AP組，GA低、中、高濃度組細胞總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照試劑盒使用說明進行PCR，以GAPDH為內(nèi)參。DUSP1上游引物序列：5’-CCCTGAGTACTAGCGTCCCT-3’，下游引物序列：5’-GGCCACCCTGATCGTAGAGT-3’；GAPDH上游引物序列：5’-TCCTGTTCGACAGTCAGCCGCA-3’，下游引物序列：5’-ACCAGGCGCCCAATACGAC CA-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；60 ℃延長5 min。相對表達量用2-ΔΔCt法計算。實驗重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0進行分析，AP+pcDNA和AP+pcDNA-DUSP1組間各指標比較行兩獨立樣本t檢驗，其他多組間各指標比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.15組AP細胞上清中IL-6、TNF-α分泌水平結(jié)果見表1。

表1 5組AP細胞IL-6、TNF-α水平比較(n=3) ng/L

2.25組細胞的凋亡情況結(jié)果見表2。

2.35組AP細胞中DUSP1的表達結(jié)果見表3。

表2 5組細胞凋亡情況比較(n=3)

表3 5組細胞中DUSP1表達的比較(n=3)

2.4AP+pcDNA組和AP+pcDNA-DUSP1組細胞檢測指標比較結(jié)果見表4。與AP+pcDNA組比較，AP+pcDNA-DUSP1組DUSP1蛋白表達水平升高，上清中IL-6、TNF-α水平降低，細胞凋亡率升高，Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高。

2.54組AP細胞檢測指標比較結(jié)果見表5。與AP組比較，AP+GA組DUSP1表達水平升高，IL-6、TNF-α水平降低，細胞凋亡率升高，Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高；與AP+GA和AP+GA+si-NC組比較，AP+GA+si-DUSP1組DUSP1表達水平降低，IL-6、TNF-α水平升高，細胞凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低。

表4 AP+pcDNA組和AP+pcDNA-DUSP1組細胞檢測指標比較(n=3)

表5 4組AP腺泡細胞檢測指標比較(n=3)

3 討論

AP根據(jù)嚴重程度分為輕癥、中癥和重癥。輕癥AP較為常見，且預(yù)后良好；但重癥AP病情多變，致死率高；炎癥因子及細胞凋亡在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用；AP中胰腺損傷主要表現(xiàn)為腺泡細胞的凋亡和壞死，壞死的細胞會釋放大量炎癥因子，AP的嚴重程度與胰腺腺泡細胞凋亡呈負相關(guān)；誘導細胞凋亡可在一定程度上減輕AP[9-10]。研究[11]表明中藥治療AP臨床療效較好應(yīng)。有研究[12]報道GA可通過調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3) / Janus激酶2(JAK-2)/ sirtuin-1(SIRT-1)減輕缺血性中風大鼠的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元損傷。GA可通過減弱體內(nèi)炎癥反應(yīng)、腎損傷以及腎小管凋亡來保護小鼠免受脂多糖誘導的急性腎臟損傷[13]。本研究結(jié)果顯示，雨蛙素誘導的AR42J細胞分泌IL-6、TNF-α水平降低，細胞凋亡率升高，Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高；提示GA可抑制雨蛙素誘導的AR42J細胞炎癥因子的釋放以及促進腺泡細胞凋亡，表明GA可能減輕AP嚴重程度。

且本實驗還發(fā)現(xiàn)雨蛙素處理大鼠胰腺腺泡細胞AR42J中DUSP1表達水平降低。說明DUSP1可能參與了AP的進展。已有研究[14]報道沉默DUSP1可促進AP小鼠促炎細胞因子的釋放。且還有研究[15]報道DUSP1可保護JAK2V617F驅(qū)動的真性紅細胞增多癥祖細胞免受炎癥應(yīng)激和DNA損傷。MKP-1可調(diào)節(jié)LPS誘導的促炎性巨噬細胞活化和炎癥反應(yīng)[16]。DUSP1在心肌缺血再灌注損傷中表達下調(diào)，上調(diào)其表達可減輕缺血再灌注誘導的心肌損傷[17]。本研究結(jié)果顯示，過表達DUSP1可降低雨蛙素誘導的AR42J細胞炎癥因子水平，促進細胞凋亡。本實驗還發(fā)現(xiàn)AP+GA組細胞中DUSP1表達水平升高，IL-6、TNF-α水平降低，細胞凋亡率升高，Bcl-2表達降低，Bax表達升高，而干擾DUSP1表達逆轉(zhuǎn)了GA對雨蛙素誘導的AP腺泡細胞炎癥因子和凋亡的影響，提示GA對雨蛙素誘導的AP腺泡細胞炎癥因子和凋亡的影響與DUSP1表達有關(guān)。

綜上所述，GA可通過上調(diào)DUSP1表達抑制雨蛙素誘導的AP腺泡細胞炎癥反應(yīng)，促進細胞凋亡。