郭 群，任曉玉，張 琦，聶木蘭，徐 璐，龍倩梅，郭一凡，王 東，劉 斌，何 瑋，金銀川

（1.濱州醫(yī)學院，山東 煙臺264000；2.濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東 濱州256600；3.第四軍醫(yī)大學，陜西 西安710000）

缺血性腦卒中是全球范圍內(nèi)居民死亡、致殘的重要原因［1］，目前針對缺血性腦卒中的主要治療方法是通過靜脈溶栓恢復大腦血流［2］，但是這類治療方法有嚴格的時間窗，僅有一部分患者能夠在嚴格的時間窗內(nèi)接受溶栓治療［3］，并且溶栓治療還可能帶來再灌注損傷等問題［4］，因此通過藥物或生物活性物質(zhì)來保護缺血性腦卒中后的大腦尤為重要，但是目前各種神經(jīng)保護藥物或者生物活性物質(zhì)的探索與運用仍然不足。近年來，骨橋蛋白在缺血性腦卒中發(fā)病中的神經(jīng)保護作用逐漸引起了關注，本文綜述了近年關于骨橋蛋白在缺血性腦卒中發(fā)病中腦保護作用及其機制的研究進展，希望促進對于骨橋蛋白腦保護作用及機制的研究，盡早闡明其作用機制及治療運用方法，豐富針對缺血性腦卒中的腦保護藥物或生物活性物質(zhì)的選擇，最終降低缺血性腦卒中的致死率、致殘率。

1 概述

缺血性腦卒中是腦卒中最常見的類型［5］，是指各種腦血管病變所致腦部血液供應障礙，導致的局部腦組織缺血、缺氧性急性壞死，而迅速出現(xiàn)相應神經(jīng)功能缺損的一類臨床綜合征［6］，主要損傷機制為在神經(jīng)組織急性缺血缺氧的基礎上繼發(fā)神經(jīng)細胞凋亡、氧化應激、炎癥反應、血腦屏障破壞、免疫系統(tǒng)平衡失調(diào)等一系列級聯(lián)反應，最終導致永久性局部神經(jīng)組織壞死和神經(jīng)功能缺損［7‐11］。骨橋蛋白（OPN）由分泌型磷蛋白‐1 基因表達［12］，是一種由314 個氨基酸組成的磷酸化糖蛋白，在肺、心、腦、骨等多種組織中表達［13］，同時在阿爾茨海默病、帕金森病、癲癇、腦卒中等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮保護作用。OPN 含有一個RGD（精氨酸‐甘氨酸‐天冬氨酸）結(jié)合域、一個凝血酶切割位點、一個鈣結(jié)合位點、兩個肝素結(jié)合位點，其中OPN 主要通過RGD 序列結(jié)合αvβ3、αvβ5 等整合素與神經(jīng)細胞等多種細胞相互作用，發(fā)揮保護、調(diào)節(jié)炎癥、促細胞遷移等功效［14］，而凝血酶切割后則會暴露一個SVVYGLR 序列［15］，該序列可介導與α9β1，α4β1 和α4β7 整合素及CD44 受體的相互作用［16］，該序列的探索相對較少。

2 OPN 在缺血性腦卒中發(fā)病中腦保護作用機制的研究進展

目前針對缺血性腦卒中腦保護的策略主要從抗炎、促進膠質(zhì)細胞增值、促血管新生、保護血腦屏障等角度切入，既往研究顯示，在缺血性腦卒中發(fā)生后的3～24 h 內(nèi)，骨橋蛋白在梗死核心和梗死周圍區(qū)域的小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞中被誘導，并在第7天達到高峰，通過促使小膠質(zhì)細胞極化向保護性M2 表型轉(zhuǎn)變、減輕神經(jīng)炎癥、血運重建、誘導可塑性等途徑影響腦梗死體積、急性期神經(jīng)功能狀態(tài)和遠期預后［17，18］，也有研究認為，相對于炎癥因子等，骨橋蛋白的表達較晚，可能在形成新屏障等組織重塑中作用更為明顯［19］。

2.1 抗炎

缺血性腦卒中發(fā)生后，由于缺氧、缺血等損傷導致神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境改變，致使小膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞等進入應激狀態(tài)，這些細胞活化后釋放各種炎性細胞因子，比如白細胞介素‐6（IL‐6）、組織壞死因子‐α（TNF‐α）等，這些炎性細胞因子除了本身的細胞毒性以外，還誘導選擇素等黏附分子的表達，而黏附分子則誘導白細胞遷移、聚集，導致血栓形成加快，并且聚集而來的白細胞可以釋放更多的炎性介質(zhì)，如誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP），進一步加重腦血流阻塞并促進血腦屏障（BBB）的損傷；隨著BBB 的損傷，外周循環(huán)中的單核/巨噬細胞可募集到缺血腦組織中，其中的MMP2、MMP9 以及氧自由基（ROS）等細胞毒性物質(zhì)都會進一步繼續(xù)損害血腦屏障，最終導致外周的白細胞大量浸潤腦實質(zhì)伴隨更大量的炎癥介質(zhì)釋放，整個過程呈級聯(lián)式不斷加重腦損傷［20，21］。因此，炎癥是缺血性腦卒中的重要病理生理環(huán)節(jié)，并與缺血性腦卒中的遠期預后有關［22］?，F(xiàn)在也有一些抗炎藥物的研究，比如阻斷細胞因子的IL‐1 阻斷劑（戊硫氧嘧啶）、TNF‐α 阻斷劑、神經(jīng)肽類等，但是均效 果 欠 佳［23，24］。骨 橋 蛋 白 的 早 期 研 究 中，Meller等［25］給予缺血性腦卒中大鼠外源性OPN，發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血的面積減少，并可能是通過整合素受體發(fā)揮作用，Jin 等［26］在進一步研究中發(fā)現(xiàn)含有RGD 序列的OPN 具有良好的減輕缺血性腦卒中梗死面積的作用，并且缺血半球中TNF‐α、IL‐1β 等炎性物質(zhì)被顯著抑制，而當在RGD 序列組加入抗αvβ3 抗體或者使用RGD 變異序列時，上述抗炎作用則明顯消退。這些結(jié)果表明，含有RGD 的OPN 通過αvβ3 整合素發(fā)揮抗炎作用。但是，Chung 等［27］發(fā)現(xiàn)，大腦在缺血性腦卒中后的第4～8 周會迎來第2 次的炎癥爆發(fā)，而在這個過程中，OPN‐/‐小鼠（OPN 基因敲除的小鼠）的梗死區(qū)域中MMP 等相關炎癥因子的表達反而顯著降低，并且繼發(fā)性神經(jīng)減退的程度也較低，具體表現(xiàn)為梗塞區(qū)域神經(jīng)元保留較多、運動功能恢復更快等。其原因可能為腦梗死區(qū)域吞噬細胞不能有效清除富含膽固醇的髓鞘碎片造成大量膽固醇晶體存在進而導致OPN 表達升高持續(xù)促進慢性炎癥所致，但是具體的機制仍未闡明。所以，對于骨橋蛋白的抗炎作用及機制尤其是作用時效仍需進一步研究。

2.2 促小膠質(zhì)細胞遷移與運動

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，小膠質(zhì)細胞在免疫和炎癥反應中均發(fā)揮重要作用。雖然生理條件下大多數(shù)小膠質(zhì)細胞保持靜息狀態(tài)，但是即使是微小的病理刺激，小膠質(zhì)細胞也會被迅速激活，成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）損傷后最早反應的細胞。激活后的小膠質(zhì)細胞涉及增殖、遷移至損傷部位、免疫調(diào)節(jié)劑表達增加以及轉(zhuǎn)化為吞噬細胞等，活化的小膠質(zhì)細胞也通過釋放細胞因子、一氧化氮（NO）和ROS 等促炎性因子介導神經(jīng)元的損傷［28，29］。因此小膠質(zhì)細胞在神經(jīng)系統(tǒng)損傷中發(fā)揮雙重作用，即促炎型（M1）和 抗 炎 型（M2），M1 傾 向 于 釋 放TNF‐α、iNOS、IL‐1β 等破壞性介質(zhì)；M2 產(chǎn)生有益的介質(zhì)，如IL‐4、轉(zhuǎn)化生長因子‐β（TGF‐β）等［30］。因此，促使小膠質(zhì)細胞的遷移、增殖及向M2 型的轉(zhuǎn)化極為重要。以往的研究一般使用姜黃素、丹皮酚、miRNA124 等來促進小膠質(zhì)細胞的表型轉(zhuǎn)化［29，31，32］，但均效果欠佳。隨著研究的進一步深入，Ladwig 等［33］發(fā)現(xiàn)在缺血性腦卒中發(fā)病中，OPN 可以促進小膠質(zhì)細胞向M2 表型的表達，并且可以降低M1 型小膠質(zhì)細胞iNOS 的表達。同時發(fā)現(xiàn)M1 和M2 表型小膠質(zhì)細胞往往互相重疊，而骨橋蛋白可以促進M2 表型的小膠質(zhì)細胞從重疊區(qū)域分離，并且這種M1 和M2 型小膠質(zhì)細胞的分離可能對卒中后的結(jié)局是有益的。其他研究也發(fā)現(xiàn)，OPN 可以增加應激狀態(tài)下小膠質(zhì)細胞的存活，并且抑制小膠質(zhì)細胞超氧化物生成甚至可以直接清除氧自由基，但是在OPN 與小膠質(zhì)細胞的遷移、吞 噬 等 方 面 未 發(fā) 現(xiàn) 明 顯 促 進 作 用［34，35］。Kim等［36］卻有了新發(fā)現(xiàn)，他們發(fā)現(xiàn)含有RGD 和SLAY基序的OPN 可以明顯增強BV2 細胞（小膠質(zhì)系的一種）的吞噬能力，并可以增強BV2 細胞的運動速度、偽足長度等指標，同時與細胞運動有關的F‐肌動蛋白的強度及陽性區(qū)域均顯著增加［37］。因此骨橋蛋白可能通過小膠質(zhì)細胞發(fā)揮腦保護作用。

2.3 促神經(jīng)干細胞遷移

神經(jīng)干細胞（NSCs）是一種多潛能細胞，具有很強的自我更新能力并可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞等。內(nèi)源性神經(jīng)干細胞廣泛存在于脊髓齒狀回顆粒下區(qū)、腦室下區(qū)等。在缺血性腦卒中發(fā)生后，這些特定區(qū)域的神經(jīng)干細胞急劇上調(diào)，并且通過受損組織所釋放的趨化因子遷移至梗死核心，隨后分化為受損類型的神經(jīng)細胞，這種遷移在缺血性腦卒中治療中非常重要，因為損傷部位原有的神經(jīng)干細胞無法支持功能修復，而遷移來的NSC 除了分化以外還可以分泌適當數(shù)量和類型的信號因子，持續(xù)影響缺血區(qū)域的微環(huán)境，因此也有助于對缺血性腦卒中損傷做出個性化反應［38，39］。既往研究一般使用外源性神經(jīng)干細胞進行靜脈或者經(jīng)腦實質(zhì)的移植，并觀察到外源性神經(jīng)干細胞移植后可促進內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖和遷移，抑制炎癥、促進突觸重塑、刺激新血管形成，這一過程可能是與分泌一些神經(jīng)營養(yǎng)因子有關。雖然外源性神經(jīng)干細胞對于缺血性腦卒中有一定治療作用，但由于倫理、治療效果和安全性問題，外源性NSC 移植療法仍距離臨床應用階段非常遙遠［38，40］。除此之外，也有研究試圖使用重復經(jīng)顱磁刺激等手段來促進缺血性腦卒中后神經(jīng)干細胞功能的分化，但效果欠佳［41］。雖然內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的遷移對于缺血性腦卒中發(fā)病區(qū)域的治療非常重要，但是這種遷移對于嚴重的大腦損傷來說遠遠不夠［42］。Rogall 等［43］使用DCX‐luc轉(zhuǎn)基因小鼠（這種小鼠可以通過腹腔注射熒光劑使大腦呈現(xiàn)熒光狀態(tài)，并使神經(jīng)干細胞的遷移呈現(xiàn)“熱點”狀態(tài)，便于觀察［44］）造模，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OPN 治療后的NSC 的遷移距離及擴展數(shù)量極大地增加，并且在第7～28 天增強較為明顯。在類似研究中，Ra‐benstein 等［45］在給予缺血性腦卒中動物模型OPN 的同時加入G 蛋白偶聯(lián)受體4（CXCR4）的阻斷劑AMD3100，而CXCR4 一直被認為與神經(jīng)干細胞的遷移有密切關系［46，47］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阻斷CXCR4 可以完全消除OPN 對NSC 的遷移誘導?？傊?，骨橋蛋白對于神經(jīng)干細胞的遷移可能有密切關系，還可能與CXXR4 受體有關，并因此起到腦保護的作用。

2.4 促進血管生成

缺血性腦卒中所致神經(jīng)元凋亡的嚴重程度往往取決于腦血流量減少的時間，因此促進缺血性腦卒中后梗死區(qū)域的血流恢復對于恢復梗死區(qū)域的供血、供氧，減少神經(jīng)元凋亡非常重要［48］。但是，如前文所述，并不是所有患者都能及時接受再通治療，因此通過藥物等促進血管生成逐漸引起了更多的關注。血管生成是一個多步驟的過程，涉及內(nèi)皮細胞增殖、遷移、管形成、分支和吻合等［49］。許多生長因子與這一過程有關，包括血管生成因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（FGF2）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）等［50］。目前的促血管生成的手段主要包括：（1）藥物：比如芬戈莫德［51］；（2）細胞因子：如VEGF、FGF2 等，尤其是VEGF 比較多見，但是VEGF 有著引起血管通透性增加、導致滲漏的風險［52］；（3）其他：比如miRNA、重復的顱腦磁刺 激 等 等，但 均 效 果 有 限。Lee 等［53］發(fā) 現(xiàn) 使 用 含RGD 和SLAY 兩種基序的OPN 治療缺血性腦卒中大鼠，其腦梗死灶中的血管長度顯著增加（對照組的226.1%±11.2%），并且OPN 治療大鼠的缺氧明顯減輕。同樣是加用抗αvβ3 整合素抗體后可以降低這種改善，表明OPN 的RGD 和SLAY 基序與αvβ3 整合素的結(jié)合在促進缺血性腦卒中后腦血管生成中發(fā)揮重要作用，當然，這兩種基序是否同樣重要仍需進一步研究。

2.5 修復血腦屏障

血腦屏障（BBB）屬于神經(jīng)血管單元，由內(nèi)皮細胞、周細胞、星形細胞末端足和基底膜組成［54］，其中星形細胞突起幾乎完全包裹腦毛細血管并覆蓋于血管腔外內(nèi)皮細胞的表面［55］，同時星形膠質(zhì)細胞的末端表達大量的ATP 敏感性鉀通道，并且水通道蛋白‐4（AQP4）在星形膠質(zhì)細胞末端大量表達并定位，以此來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外鉀通量及大腦與循環(huán)之間的水通量，此外星形膠質(zhì)細胞釋放如膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）、NO 等化學物質(zhì)以發(fā)揮營養(yǎng)神經(jīng)元、神經(jīng)遞質(zhì)清除和再循環(huán)、調(diào)節(jié)BBB 的作用［55‐57］，因此星形膠質(zhì)細胞對于BBB 的結(jié)構(gòu)和功能的完整非常重要。當缺血性腦卒中發(fā)生后，由于MMPs 的產(chǎn)生導致細胞間緊密連接遭到破壞，血腦屏障喪失其結(jié)構(gòu)的完整性，進而導致大量的神經(jīng)毒性物質(zhì)、大分子、炎性細胞等滲入腦組織，同時BBB功能障礙可進一步導致血管源性水腫形成和出血性轉(zhuǎn)化，最終會加速神經(jīng)損傷和認知障礙［58］。目前保護血腦屏障的治療主要是藥物治療如抗MMPs的抗壞血酸、丙泊酚等，抗炎的黃體酮等，以及低溫治療等方法，但是效果仍不理想［59］。既往一些研究發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白在血腦屏障功能受損的血管中表達增加［60］，在進一步的研究中，Gliem 等［61］通過追蹤AQP4 以觀察星形膠質(zhì)細胞的分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在OPN‐/‐的缺血性腦卒中模型中，AQP4 的表達相對野生型小鼠下降，并且OPN‐/‐小鼠的星形膠質(zhì)細胞主要表達于梗死區(qū)域外圍，未能向病變核心延伸其突起，同時正常表達大量AQP4 的星形膠質(zhì)細胞末端未能充分覆蓋新生血管，由于梗死核心區(qū)域缺少功能正常的星形膠質(zhì)細胞，血腦屏障持續(xù)滲漏。因此，骨橋蛋白對于血腦屏障的重建可能有著重要作用，但是相關研究仍需完善。

3 展望

隨著生物科技的不斷發(fā)展，各種制藥技術也不斷進步，Jin 等［62］研究發(fā)現(xiàn)使用明膠微球作為OPN的載體通過快速、持續(xù)的釋放方式可以增強其神經(jīng)保 護 作 用，而Joachim 等［63］進 一 步 制 造 了 可 攜 帶OPN 的明膠納米顆粒（GNP），并且證明了這些攜帶OPN 的GNP 在鼻內(nèi)給藥后擁有良好的進入腦實質(zhì)、發(fā)揮腦神經(jīng)元保護的能力。

總之，骨橋蛋白是一種效果理想的缺血性腦卒中的神經(jīng)保護蛋白，隨著其保護機制的研究深入及運用手段的不斷成熟，相信可以在臨床治療中更好應用。