楊 靜，任 星，張菀桐，高 蕊

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京100029；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京100091）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種常見(jiàn)的重要血管疾病，通常從受累動(dòng)脈內(nèi)膜開(kāi)始，先后出現(xiàn)多種病變，包括脂質(zhì)和復(fù)合糖類的局部積聚、纖維組織增生、鈣質(zhì)沉積形成斑塊和動(dòng)脈中膜的退變［1］。目前心腦血管疾病對(duì)人類的生命健康已構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅［2，3］，AS 作為心腦血管疾患的重要危險(xiǎn)因素，發(fā)病率逐年增高，且呈現(xiàn)一定的年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重危及人類健康。因此，有效防治AS 成為了預(yù)防心腦血管疾病發(fā)生的關(guān)鍵［4］。目前抗AS 的治療主要通過(guò)他汀類降脂藥物進(jìn)行干預(yù)，但其長(zhǎng)期用藥的安全性備受爭(zhēng)議。劉昌孝［5］在對(duì)他汀類藥物的安全性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中發(fā)現(xiàn)該類藥物具有肝損害、增加癌癥風(fēng)險(xiǎn)以及造成骨骼肌損害等不良反應(yīng)。中醫(yī)認(rèn)為痰濁、瘀血、毒邪（熱毒）阻滯損傷脈絡(luò)，日久脈絡(luò)瘀阻，是AS 發(fā)生的病機(jī)［6］，中醫(yī)中藥治療AS 具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)及特色，多通過(guò)化痰泄?jié)帷⒒钛?、清熱解毒等進(jìn)行治療［7］。

藏紅花，又名“西紅花”、“番紅花”，為鳶尾科植物番紅花的干燥柱頭，性味甘、微寒，歸心、肝經(jīng)，功能活血化瘀，涼血解毒，解郁安神，適用于經(jīng)閉癥瘕，產(chǎn)后瘀阻，溫毒發(fā)斑，憂郁痞悶，驚悸發(fā)狂［8］。目前已有較多研究報(bào)告了藏紅花對(duì)心腦血管疾病的治療，認(rèn)為藏紅花酸可能是其作用的物質(zhì)基礎(chǔ)［9］。有學(xué)者利用藏紅花酸干預(yù)AS 大鼠模型發(fā)現(xiàn)其可以下調(diào)大鼠主動(dòng)脈LOX-1 的表達(dá)，對(duì)AS 具有一定的療效。Asdaq 等［11］給予血脂異常大鼠藏紅花提取液，與對(duì)照組進(jìn)行比較，藏紅花可顯著調(diào)節(jié)大鼠脂代謝紊亂從而到達(dá)抗AS 效果。以上研究表明，藏紅花具有一定的抗AS 作用，但其具體作用成分和機(jī)制尚未完全明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為藥理學(xué)的分支學(xué)科，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)方法分析藥物與疾病及其靶點(diǎn)間的“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”的協(xié)同作用關(guān)系，各中藥在不同方劑中的配伍及加減運(yùn)用亦體現(xiàn)了其多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特性，兩者特點(diǎn)相一致［12］。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析藏紅花抗AS 的活性成分及其作用機(jī)制，以指導(dǎo)臨床用藥并為下一步的藥理研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 獲取藏紅花藥物候選靶點(diǎn)

登錄中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TC‐MSP Databases），搜索并獲取藏紅花的藥物化學(xué)成分，根據(jù)類藥性≥0.18 進(jìn)一步篩選藏紅花的有效化合物。根據(jù)藥物已知成分，在TCMSP Databasess 及Genecards Databases 獲取成分作用靶點(diǎn)，將獲取的靶點(diǎn)進(jìn)行去重處理，排除重復(fù)靶點(diǎn)。運(yùn)用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)査詢靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)的基因簡(jiǎn)稱，得到藏紅花調(diào)控的疾病靶點(diǎn)。構(gòu)建候選藥物成分-候選靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（candidate compound-candidate target network，cCcT network）

1.2 獲取AS 靶點(diǎn)

登錄DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取疾病藥物作用靶點(diǎn)，以atherosclerosis（動(dòng)脈粥樣硬化）為關(guān)鍵詞，人類基因?yàn)楸尘?，提取?shù)據(jù)庫(kù)中信度較高（score>0.001）的相關(guān)基因靶點(diǎn)，進(jìn)行去重、統(tǒng)一名稱等處理，獲取疾病相關(guān)基因。 將所獲取的基因?qū)隒yto‐scape3.7.2 軟件中構(gòu)建分子網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行可視化加工和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，得到疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（Disease-po‐tential target network，D-pT network）。

1.3 藏紅花成分-AS 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)映射cC-cT network 于D-pT network，得到藏紅花藥物成分治療AS 的靶點(diǎn)，應(yīng)用Cyto‐scape3.7.2 軟件構(gòu)建藥物-候選成分-AS 的候選靶點(diǎn)網(wǎng) 絡(luò)（Herb-potential compound-potential target net‐work，H-pC-pT network）。

1.4 GO 生物進(jìn)程及KEGG 通路分析

將cC-cT network 與D-pT network 的映射基因?qū)隒ytoscape3.7.2 軟件的ClueGO 插件中進(jìn)行GO生物進(jìn)程及KEGG 通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 藏紅花藥物化學(xué)成分篩選

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，以藏紅花、西紅花、番紅花為檢索詞，以類藥性≥0.18 為條件篩選得到20 個(gè)化合物，并參考相關(guān)文獻(xiàn)加入2 個(gè)藏紅花常用活性成分［13，14］，共 得 到22 個(gè) 藏 紅 花 的 有 效 活 性 成 分。見(jiàn)表1。

表1 藏紅花活性成分基本信息Tab 1 Basic information of active components in saffron

2.2 藏紅花藥物候選靶點(diǎn)篩選

將上述獲得的22 個(gè)藏紅花活性成分引入TC‐MSP 數(shù)據(jù)庫(kù)及Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得16 個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)113 個(gè)疾病靶點(diǎn)（其中有6 個(gè)活性成分的疾病靶點(diǎn)未被TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)及Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)收錄）。將上述獲得的藏紅花作用靶點(diǎn)輸入到Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中査詢靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)的基因簡(jiǎn)稱，剔除非人源靶點(diǎn)后最終得到藏紅花調(diào)控的疾病靶點(diǎn)106 個(gè)。構(gòu)建候選藥物成分-候選靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。見(jiàn)圖1。該網(wǎng)絡(luò)共包含123 個(gè)節(jié)點(diǎn)，271 條邊。其中16 個(gè)節(jié)點(diǎn)代表藏紅花活性成分，106 個(gè)節(jié)點(diǎn)代表活性成分作用的疾病靶點(diǎn)，255 條邊代表成分與靶點(diǎn)之間的作用關(guān)系。越靠近中心的靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中度越高，說(shuō)明藏紅花中有多種藥物成分作用于該靶點(diǎn)。

圖1 藏紅花成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Target network of saffron composition

2.3 AS 候選靶點(diǎn)篩選

應(yīng)用DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)，以atherosclerosis 為關(guān)鍵詞檢索，獲得數(shù)據(jù)庫(kù)中信度較高（score>0.001）的相關(guān)基因靶點(diǎn)共117 個(gè)。利用Cytoscape3.7.2 軟件進(jìn)行可視化加工和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，構(gòu)建疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包含118 個(gè)節(jié)點(diǎn)，2 151 條邊，越靠近內(nèi)層說(shuō)明該靶點(diǎn)與疾病的相關(guān)度越高。見(jiàn)圖2。

圖2 疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Disease-target network

2.4 藏紅花成分-AS 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藏紅花藥物候選靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（cC-cT network）映射于AS 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（D-pT network），結(jié)果提示，藏紅花作用于26 個(gè)疾病靶點(diǎn)。見(jiàn)表2。應(yīng)用Cyto‐scape3.7.2 軟件構(gòu)建藥物-候選成分-AS 的候選靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（H-pC-pT network）。該網(wǎng)絡(luò)包含39 個(gè)節(jié)點(diǎn)，101 條邊。其中11 個(gè)節(jié)點(diǎn)代表藏紅花活性成分，26個(gè)節(jié)點(diǎn)代表藏紅花作用于AS 的靶點(diǎn)（基因簡(jiǎn)稱）。在網(wǎng)絡(luò)中，一個(gè)節(jié)點(diǎn)的度表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連路線的條數(shù)。在化合物方面，有3 個(gè)化合物的度值≥6，分別是藏紅花酸（crocetin），異鼠李素（isorhamne‐tin），槲皮素（quercetin）。提示在藏紅花治療AS 的過(guò)程中，藏紅花酸、異鼠李素、槲皮素3 種化學(xué)成分可能起主要作用。在化合物作用的疾病靶點(diǎn)方面，有4個(gè)靶點(diǎn)的相關(guān)度值較高，分別是內(nèi)皮型一氧化氮合酶（NOS3），凝血酶（F2），過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG），前列腺素G/H 合酶2（PTGS2）。說(shuō)明在藏紅花治療AS 的過(guò)程中，作用的主要靶點(diǎn)是內(nèi)皮型-氧化氮合酶，凝血酶，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ 及前列腺素G/H 合酶2。這體現(xiàn)了藏紅花多成分與多靶點(diǎn)之間共同作用的機(jī)制。見(jiàn)圖3。

表2 中藥藏紅花活性成分抗動(dòng)脈粥樣硬化的靶點(diǎn)Tab 2 Targets of saffron active components against athero?sclerosis

圖3 藥物-候選成分-動(dòng)脈粥樣硬化的候選靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig 3 Drug-candidate component-atherosclerosis candidate target network

2.5 藏紅花與AS 相互關(guān)系的GO 生物進(jìn)程分析及KEGG 通路研究

將藏紅花作用于AS 的26 個(gè)基因靶點(diǎn)導(dǎo)入Cy‐toscape3.7.2 軟件的ClueGO 插件中進(jìn)行GO 及KEGG 通路富集分析，得到藏紅花治療AS 相互關(guān)系的GO 生物進(jìn)程及KEGG 通路結(jié)果。

2.5.1 生物進(jìn)程聚類分析結(jié)果 通過(guò)GO 生物進(jìn)程分析，獲得12 個(gè)藏紅花治療AS 生物進(jìn)程。見(jiàn)圖4。圖中面積越大，表示聚類至此生物功能的映射靶點(diǎn)越多，可得知藏紅花治療AS 可能主要是通過(guò)參與影響以下體內(nèi)生物進(jìn)程：（1）活性氧代謝過(guò)程的正調(diào)控；（2）調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖；（3）活性氧生物合成過(guò)程；（4）膠質(zhì)細(xì)胞增殖的正調(diào)控；（5）趨化因子的生物合成過(guò)程等。

圖4 藏紅花抗AS GO 生物進(jìn)程聚類分析結(jié)果Fig 4 Cluster analysis results of saffron anti-AS and GO biological process

2.5.2 KEGG 聚類分析結(jié)果 為進(jìn)一步探究藏紅花抗AS 的具體機(jī)制，開(kāi)展KEGG 通路探索，共獲得23 個(gè)信號(hào)通路，將其中與AS 相關(guān)的通路作為研究候選通路，包括：（1）VEGF 信號(hào)通路；（2）糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路；（3）流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路；（4）NF-kappaB 信號(hào)通路。見(jiàn)圖5。

圖5 藏紅花抗AS KEGG 通路Fig 5 KEGG pathway of saffron in the treatment of atherosclerosis

2.5.3 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探索藏紅花抗AS 的作用機(jī)制 結(jié)合上文藏紅花與AS 相互關(guān)系的GO 生物進(jìn)程及KEGG 通路結(jié)果?？傻弥丶t花抗AS 的相關(guān)通路包括VEGF 信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路和NF-kappaB 信號(hào)通路。通過(guò)查詢上述通路在KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)作用并結(jié)合既往文獻(xiàn)，初步建立藏紅花抗AS 的相關(guān)通路示意圖。見(jiàn)圖6。

圖6 藏紅花抗AS 相關(guān)通路示意圖Fig 6 Pathway of saffron in treatment of atherosclerosis

3 討論

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過(guò)分析藏紅花與AS 分子網(wǎng)絡(luò)在生物功能方面的異同，初步探索藏紅花抗AS 的作用機(jī)制。GO 生物進(jìn)程聚類分析和KEGG 通路聚類分析表明藏紅花抗AS 可能主要通過(guò)參與活性氧代謝過(guò)程的正調(diào)控、調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖、活性氧生物合成過(guò)程、膠質(zhì)細(xì)胞增殖的正調(diào)控、趨化因子的生物合成過(guò)程等生物進(jìn)程。在信號(hào)通路的調(diào)控方面，藏紅花抗AS 可能主要調(diào)控VEGF信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路和NF-kap‐paB 信號(hào)通路。晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）是由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸的非酶促糖基化和氧化產(chǎn)生的一組復(fù)雜的化合物［15］。RAGE 作為AGE 的模式識(shí)別受體，屬于免疫球蛋白超家族細(xì)胞表面分子的多配體受體，與積極參與炎癥和免疫反應(yīng)的配體相結(jié)合［16］。

AGE/RAGE 信號(hào)傳導(dǎo)引起涉及NADPH 氧化酶、蛋白激酶C 和MAPKs 的多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑的激活，從而導(dǎo)致NF-κB 活化［1-19］。NF-κB 能促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子（如IL-1、IL-6 和TNF-α）以及與AS 相關(guān)的 基 因 血 管 內(nèi) 皮 生 長(zhǎng) 因 子（VEGF）的 表 達(dá)［20］。VEGF 能特異性地促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的生長(zhǎng)因子，刺激內(nèi)皮細(xì)胞合成氧化氮并上調(diào)氧化氮合酶的表達(dá)，促進(jìn)新生血管形成［21］。新生血管管壁不完整，通透性強(qiáng)，可為斑塊局部提供養(yǎng)分，進(jìn)一步促進(jìn)AS 的發(fā)展［22］。剪切應(yīng)力代表了血流施加在血管壁內(nèi)皮表面的摩擦力，它在血管生物學(xué)中起著核心作用，并有助于AS 的發(fā)展［23］。低剪切應(yīng)力通常會(huì)上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞（EC）基因和蛋白，從而促進(jìn)動(dòng)脈壁的氧化和炎癥狀態(tài)，導(dǎo)致AS［24］。反映這種ECs 紊亂狀態(tài)的重要轉(zhuǎn)錄事件包括激活蛋白1 和核因子kappaB 的激活［25］。化合物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析顯示，藏紅花治療AS 的主要有效成分為藏紅花酸、異鼠李素、山奈酚和槲皮素。有研究表明藏紅花酸是一種天然的類胡蘿卜素二羧酸，在體內(nèi)和體外模型中都有促血管生成的作用，可以通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF 信號(hào)通路促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成［26］。藏紅花酸還能增加HO-1/NRF-2 的表達(dá)，降低核因子-κB（NF-κB）mRNA 和蛋白的表達(dá)，從而抑制AS 形成［27］。異鼠李素是從中草藥沙棘中提取的黃酮類化合物，具有抗氧化和抗炎的作用［28］。一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，異鼠李素能夠抑制小鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6 的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用［29］。槲皮素是一種中草藥中提取的黃酮類化合物。已有研究證實(shí)了它的抗炎、抗癌、抗氧化和抗凋亡活性［30］。槲皮素通過(guò)ROS 調(diào)節(jié)的PI3K/AKT 信號(hào)通路抑制炎癥和凋亡，從而減輕高果糖喂養(yǎng)誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化。槲皮素通過(guò)減少活性氧的產(chǎn)生、抑制細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，從而抑制高果糖所致的動(dòng)脈粥樣硬化［30］。

由此，筆者推測(cè)，藏紅花抗AS 可能主要通過(guò)藏紅花酸、異鼠李素及槲皮素等有效化學(xué)成分發(fā)揮抗炎及抑制血管新生的作用。