杜麗霞，占豪，姜子濤,*

(1.天津天獅學(xué)院 食品工程學(xué)院，天津 301700；2.天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

丁香羅勒(OcimumgratissimumL.)為屬唇形科羅勒屬植物。該植物在我國(guó)的東南部地區(qū)(如江西、江蘇、福建、廣東及云南等地)有大面積種植，北美、非洲和亞洲的熱帶和溫帶地區(qū)也有廣泛分布。丁香羅勒及丁香羅勒精油(OGEO)具有特殊的香氣，為重要的調(diào)味香料，特別是用于制作色拉、披薩、西餐和意大利菜肴。OGEO具有驅(qū)蚊蟲、抑菌、抗炎和鎮(zhèn)痛等活性[1-3]。在巴西、肯尼亞和印度等國(guó)對(duì)OGEO化學(xué)成分已有報(bào)道。然而，關(guān)于我國(guó)OGEO化學(xué)成分方面的研究卻極少報(bào)道。作者在前文中綜述了該精油的成分及其活性研究進(jìn)展[4]。OGEO的主要成分是丁香酚(EG)，其也是丁香、羅勒、多香果等調(diào)味香料的主要成分[5-7]。EG在食品和化妝品行業(yè)中用作調(diào)味劑和芳香劑，具有抗氧化、殺菌抑菌等生物活性，因而備受關(guān)注[8-9]。

本文采用GC-MS技術(shù)鑒定了OGEO的化學(xué)成分，利用6種不同的方法測(cè)定了OGEO的清除游離基能力、抗氧化活性和抑菌活性。并與EG和抗壞血酸(Vc)以及常見(jiàn)的合成抗氧化劑二丁基羥基甲苯(BHT)和沒(méi)食子酸丙酯(PG)的抗氧化活性進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

OGEO：采用水蒸氣蒸餾法制得，由江西天然香料公司提供(江西吉安)，精油含量>95%。鐵氰化鉀：天津化學(xué)試劑批發(fā)部；磷酸鹽(PBS)和Vc：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；BHT：福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司；PG：浙江省溫州市甌海精細(xì)化工公司；EG：上海飛祥化工廠；鄰二氮菲：天津市四通化工廠。所用試劑均為分析純。

Finnigan Trace DSQ GC-MS聯(lián)用機(jī)(EI離子源、TR-5MS色譜柱30 m×0.25 mm×0.25 μm、Mainlib Library 和 Replib Library數(shù)據(jù)庫(kù)) 美國(guó)Thermo Fisher公司；UV-2102PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；970CRT型熒光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 OGEO成分分析

利用GC-MS技術(shù)測(cè)定OGEO的化學(xué)成分。GC條件：采用程序升溫控制柱箱溫度，以15 ℃/min的升溫速率使柱箱溫度由50℃上升到280 ℃，然后恒溫10 min。載氣(He)流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量0.3 μL，分流比40∶1。MS條件：電子束能量70 eV；接口和離子源溫度均為250 ℃；質(zhì)量掃描范圍14～450 m/z。

1.3 OGEO的抗氧化活性

1.3.1 普魯士蘭法

參照文獻(xiàn)[10-11]所采用的普魯士蘭法，測(cè)定了OGEO的抗氧化活性。為便于說(shuō)明和比較OGEO的抗氧化活性，分別利用EG、Vc、BHT和PG來(lái)替代OGEO，進(jìn)行比較測(cè)定。

1.3.2 抑制脂質(zhì)過(guò)氧化活性

1.3.2.1 硫氰酸鐵(FTC)法

按照文獻(xiàn)[12]的方法并適當(dāng)改進(jìn)，通過(guò)測(cè)定亞油酸在氧化過(guò)程中過(guò)氧化物含量的變化，來(lái)評(píng)價(jià)OGEO的抑制脂質(zhì)過(guò)氧化活性。為便于比較，同時(shí)也測(cè)定了EG、BHT及PG的抑制脂質(zhì)過(guò)氧化活性。

1.3.2.2 硫代巴比妥酸(TBA)法

參照文獻(xiàn)[12]的方法并適當(dāng)改進(jìn)。本法前期所用試劑及具體做法與FTC法一致。試液在恒溫箱中反應(yīng)10 d后，每天取該試液1 mL與20%三氯乙酸溶液1 mL混勻后靜置20 min，再加2 mL 0.3% TBA溶液，混勻后置于沸水浴中反應(yīng)10 min，冷卻至室溫后再以3000 r/min離心20 min，將離心后的上清液在532 nm下測(cè)定所生成的丙二醛(MDA)吸光度值，利用下式計(jì)算抗氧化活性：

抗氧化活性(%)=[(Ao-As)/Ao]×100%。

(1)

式中：Ao為參比的吸光度，As分別為添加OGEO、EG、BHT或PG后的吸光度。

1.3.3 清除H2O2能力

參照周寧等[13]的方法并加以改進(jìn)，測(cè)定OGEO清除H2O2的能力。具體做法：以PBS緩沖液(0.15 mol/L，pH 7.4)配制20 mmol/L H2O2溶液。取1 mL濃度分別為20，40，60，80，100 μg/mL的OGEO溶液，分別加入2 mL H2O2溶液，混勻，反應(yīng)10 min后，在230 nm處測(cè)定其吸光度值。按照式(1)計(jì)算清除H2O2的能力即抗氧化活性。

1.3.4 清除羥基自由基活性

參照文獻(xiàn)[14-15]的方法測(cè)定OGEO清除羥基自由基的活性。具體做法：取5支10 mL的比色管，按照表1列出的加入量依次加入所需的試劑，混合均勻后，將上述5支比色管同時(shí)置于恒溫水槽中，37 ℃水浴1 h，冷卻至室溫，然后在波長(zhǎng)536 nm處測(cè)定吸光值。按照式(2)計(jì)算OGEO(或EG、BHT、PG和Vc)的羥基自由基清除率：

羥基自由基清除率(%)=(As-Ap)/( Ab-Ap)×100%。

(2)

1.3.5 總體抗氧化活性的測(cè)定

用稍加改進(jìn)的Prieto等[16]的方法，具體操作同文獻(xiàn)[11]。對(duì)OGEO及EG的總抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，并將測(cè)定結(jié)果與BHT及PG的總抗氧化活性結(jié)果進(jìn)行比較。

1.4 OGEO的抑菌活性

1.4.1 抑菌直徑

OGEO及EG對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌直徑的測(cè)定參照文獻(xiàn)[11]和文獻(xiàn)[17]進(jìn)行。

1.4.2 最小抑菌濃度(MIC)

OGEO及EG對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌MIC的測(cè)定參照文獻(xiàn)[11]和文獻(xiàn)[18]進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 精油成分分析結(jié)果

按選定的GC-MS條件對(duì)OGEO進(jìn)行了分析。利用計(jì)算機(jī)標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)對(duì)比法和保留指數(shù)法，從OGEO中鑒定出15種成分，占精油總量的99.62%。OGEO的化學(xué)成分及其含量見(jiàn)表2。

表2 丁香羅勒精油(OGEO)的化學(xué)成分Table 2 The chemical components of Ocimum gratissimum L. essential oil (OGEO)

2.2 OGEO的抗氧化活性

2.2.1 普魯士蘭法

OGEO、EG、BHT、PG和Vc 5種化合物的抗氧化活性見(jiàn)圖1?；衔锾峁╇娮幽芰Φ拇笮?，直接反映了其抗氧化活性的強(qiáng)弱。化合物提供電子的能力越強(qiáng)，將鐵氰化鉀還原為亞鐵氰化鉀，進(jìn)而形成普魯士蘭的能力也就越強(qiáng)，溶液在700 nm下的吸光值也就越大，化合物的還原能力越強(qiáng)。由圖1可知，OGEO、EG、BHT、PG和Vc的抗氧化活性隨著濃度的增加而增加。分別對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行曲線擬合，得到OGEO、EG、BHT、PG和Vc的半抑制濃度(IC50)分別為175.8, 148.6，195.0，89.0，100.2 μg/mL?？梢?jiàn)利用普魯士蘭法得到的OGEO等5種化合物的抗氧化活性順序?yàn)镻G>Vc>EG>OGEO>BHT。

圖1 不同濃度下OGEO等化合物的抗氧化活性Fig.1 The antioxidant activities of OGEO and other compounds at different concentration

2.2.2 抑制脂質(zhì)過(guò)氧化活性

2.2.2.1 硫氰酸鐵法(FTC)

利用FTC法測(cè)得的OGEO、EG、BHT和PG的抑制脂質(zhì)過(guò)氧化活性見(jiàn)圖2。吸光值越小，表明化合物的抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性越強(qiáng)，其活性順序?yàn)镺GEO>EG>BHT>PG。由此得出OGEO抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)生的能力要比常見(jiàn)的合成抗氧化劑BHT和PG稍微強(qiáng)一些。而作為OGEO的主要成分EG減少脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)生的活性比OGEO的活性還弱一些。由此可見(jiàn)，OGEO中能夠減少脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)生的主要成分除EG外，還有其他的化學(xué)成分，有待于進(jìn)一步研究。由圖2可知，起初4種化合物抑制脂質(zhì)過(guò)氧化活性曲線變化明顯；但反應(yīng)6 d后，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化活性曲線變化不大，說(shuō)明OGEO、EG、BHT和PG抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物的能力均比較穩(wěn)定，基本上趨于平緩，不受到時(shí)間的影響。

圖2 OGEO等化合物抑制脂質(zhì)過(guò)氧化活性Fig.2 The lipid peroxidation inhibition activities by OGEO and other compounds

2.2.2.2 硫代巴比妥酸(TBA)法

利用TBA法測(cè)定OGEO、EG、BHT和PG抑制脂質(zhì)過(guò)氧化結(jié)果,見(jiàn)圖3。可以看出OGEO、EG、PG和BHT抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)生的能力依次為OGEO>EG>PG>BHT。與FTC法的結(jié)果一樣，OGEO抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)生的活性要比常見(jiàn)的合成抗氧化劑BHT和PG的活性稍強(qiáng)一些；同樣地，作為OGEO主要成分的EG其抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)生的活性也比OGEO稍弱一些。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了OGEO中抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的活性成分不僅僅是EG。

TBA與FTC有較多相似之處，實(shí)驗(yàn)所用儀器、試劑及實(shí)驗(yàn)要求條件大致相同，不同之處在于兩種方法所用的顯色劑。兩種方法測(cè)定抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物活性的比較結(jié)果見(jiàn)圖3，可見(jiàn)兩種方法還是非常相似的。

圖3 FTC和TBA法比較OGEO、EG、BHT和PG抑制脂質(zhì)過(guò)氧化活性Fig.3 Comparison of lipid peroxidation inhibition activities by OGEO, EG, BHT and PG using FTC and TBA methods

2.2.3 清除過(guò)氧化氫能力

在生物體內(nèi)，超氧化物歧化酶等氧化酶的酶促反應(yīng)常常形成H2O2，其能透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)一些酶的巰基氧化失活。OGEO、EG和BHT清除H2O2的結(jié)果見(jiàn)圖4，與合成抗氧化劑BHT進(jìn)行比較，OGEO及EG均顯示出較強(qiáng)的H2O2清除能力，清除率順序?yàn)镋G>OGEO>BHT，當(dāng)OGEO、EG和BHT的濃度均為80 μg/mL時(shí)，三者對(duì)H2O2的清除率分別為71.3%、79.4%和37.6%。這一結(jié)果表明OGEO和EG清除H2O2的能力均大于BHT，這是由于精油分子比BHT更容易透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。因此，OGEO和EG有較強(qiáng)的清除H2O2能力。

圖4 OGEO、EG和BHT清除H2O2的活性Fig.4 The H2O2 scavenging activities by OGEO, EG and BHT

2.2.4 清除羥基自由基活性(鄰二氮菲法)

OGEO清除·OH的活性見(jiàn)圖5中(A)。為了便于比較，我們將EG、BHT、PG和Vc清除·OH活性的測(cè)定結(jié)果也一并顯示在了圖5(A)中。由圖5中(A)可知，OGEO、EG、BHT、PG和Vc均能有效地清除·OH游離基，這也是它們均具有抗氧化活性的原因所在。由于5種化合物的用量是相同的，所以O(shè)GEO清除·OH的活性最強(qiáng)，比常見(jiàn)的抗氧化劑BHT、PG和Vc都高，清除率達(dá)到73.0%；而Vc的清除率最低，僅為30.0%。清除·OH自由基活性順序?yàn)镺GEO>EG>BHT>PG>Vc。由此可見(jiàn)，天然抗氧化劑清除·OH的能力優(yōu)于合成的抗氧化劑。而作為OGEO中的主要成分EG，它對(duì)·OH的清除率(61.1%)不及OGEO本身，這說(shuō)明OGEO中可能存在著清除·OH自由基活性比EG還要強(qiáng)的化學(xué)成分。OGEO清除·OH自由基活性的結(jié)果是精油中化學(xué)成分協(xié)同作用的體現(xiàn)。

圖5 OGEO等5種化合物清除羥基自由基的活性(A)及OGEO和EG在不同濃度下清除羥基自由基的活性(B)Fig.5 The scavenging activities of hydroxyl radical by OGEO and four other antioxidants (A) and scavenging activities of hydroxyl radicals of OGEO and EG at different concentration (B)

由圖5中(B)可知，OGEO和EG清除·OH自由基活性(Y)與它們的濃度(X)有較好的線性相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)R分別為0.992和0.986)。根據(jù)二者清除率與濃度的相關(guān)曲線可知，OGEO和EG的IC50值分別是80.0 μg/mL和157.4 μg/mL。

2.2.5 總體抗氧化能力

將OGEO、EG、BHT及PG的總抗氧化活性進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖6。OGEO及EG的總抗氧化活性均比BHT及PG的強(qiáng)一些，其中EG的總抗氧化活性最強(qiáng)，而EG為OGEO的主要成分，這說(shuō)明EG在精油抗氧化過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。

圖6 OGEO及EG等化合物的總體抗氧化活性Fig.6 The total antioxidant activities of OGEO, EG and other compounds

2.3 OGEO及EG的抑菌活性

OGEO和EG對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)中所用的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均是非常常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ骄辏罢邽闂U菌，后者為球菌，二者的實(shí)驗(yàn)承受力也有所不同，利用這兩種菌株落實(shí)抑菌實(shí)驗(yàn)具有實(shí)際意義。

表3 OGEO和EG的抑菌能力Table 3 The bacteriostatic abilities of OGEO and EG

由表3可知，OGEO和EG對(duì)這兩種細(xì)菌均具有抑制作用，并且EG的抑菌圈直徑略大于OGEO。植物精油普遍具有抑菌活性，活性大小與精油成分的分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。萜烯類和萜烯類含氧衍生物均具有一定的抑菌活性，其中酚類化合物的抑菌活性最強(qiáng)，例如前述的EG。由GC-MS分析結(jié)果可知，OGEO 中占主導(dǎo)成分的是EG，這使OGEO 和EG均具有很好的抑菌效果，并且EG的抑菌效果大于OGEO。

表4 OGEO和EG的最小抑菌濃度Table 4 The minimum inhibitory concentration of OGEO and EG

由表4可知，OGEO和EG對(duì)大腸桿菌的MIC為0.16 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.31 mg/mL，對(duì)這兩種微生物的抑菌圈直徑分別為13.0 mm和12.5 mm。Knobloch等[18]認(rèn)為精油的溶解度與精油中有效成分透過(guò)細(xì)胞進(jìn)入菌體的能力直接相關(guān)，而抑菌性則基于抑菌劑在菌體細(xì)胞膜雙層磷脂中的溶解度。精油中的萜類能夠降低生物膜的穩(wěn)定性，從而干擾了能量代謝的酶促反應(yīng)。OGEO中的抑菌成分EG起著重要作用，考慮到EG為萜類物質(zhì)，由于萜類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)同抑菌性有一定關(guān)系，盡管萜類物質(zhì)的抑菌機(jī)理還需進(jìn)一步研究，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步對(duì)抑菌機(jī)制的研究提供了一定參考依據(jù)。

3 結(jié)論

利用GC-MS技術(shù)鑒定了OGEO的化學(xué)成分；并利用普魯士蘭法、硫氰酸鐵法、硫代巴比妥酸法、清除H2O2能力、清除羥基自由基活性、總體抗氧化活性6種不同的方法測(cè)定了OGEO的抗氧化活性；初步闡述了精油主要成分與抗氧化活性的相關(guān)性。從結(jié)果來(lái)看，OGEO具有一定的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑使用。不同抗氧化活性的測(cè)定方法，反映的是化合物抗氧化活性的不同方面，其抗氧化機(jī)理也有所不同。因此，同時(shí)利用幾種不同的方法來(lái)評(píng)價(jià)OGEO的抗氧化活性，結(jié)論更客觀、更全面、更具有科學(xué)性和實(shí)際意義。天然抗氧化劑除了具有合成抗氧化劑不可比擬的安全優(yōu)勢(shì)外，在某些方面更優(yōu)于合成抗氧化劑[19-20]。OGEO對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制能力也較強(qiáng)，其來(lái)源豐富，富含EG，預(yù)計(jì)丁香羅勒在天然食品抗氧化劑和防腐保鮮中有很好的應(yīng)用前景。