張文莉，姚穩(wěn)，巫永華，秦杰，苗敬芝*

(1.徐州工程學(xué)院 食品(生物)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018；2.徐州工程學(xué)院江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室，江蘇 徐州 221018)

紅茶菌，俗稱“海寶”、“胃寶”，是一種起源于中國東北的傳統(tǒng)民間發(fā)酵型飲料。它是由醋酸菌、酵母菌和乳酸菌以茶糖水為原料混合發(fā)酵而成[1]。其母液中含有多種發(fā)酵微生物及其代謝產(chǎn)物，如茶多酚、茶黃素、多糖、氨基酸、D-葡萄糖二酸-1,4-內(nèi)酯、維生素等，具有促進新陳代謝、保肝護肝、增強機體免疫力和抗氧化等功效[2-3]。近年來，研究者以紅茶菌為對象研究開發(fā)了一系列產(chǎn)品并對其進行活性成分分析。文獻[4]以紅茶菌發(fā)酵液為基質(zhì)，添加其他3種水果原汁一起發(fā)酵，得到水果紅茶菌飲料并分析其生物活性和抗氧化性。徐清萍等[5]以谷物為原料，用紅茶菌發(fā)酵制醋，并測定其理化指標(biāo)。孫永康等[6]用紅茶菌和釀酒酵母發(fā)酵茶糖水，制備新型發(fā)酵型茶酒。

山藥，薯蕷科薯蕷屬，纏繞草質(zhì)藤本植物。《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載，山藥味甘、性平，入脾、胃、腎經(jīng)，具有健脾補肺、補腎益精等功效。研究表明，山藥中含有多糖、蛋白質(zhì)、皂苷等成分，具有抗氧化、降血糖、降血脂和提高免疫力的作用[7-8]。枸杞，茄科枸杞屬植物。枸杞中含有多種化學(xué)成分，如多糖、類胡蘿卜素、生物堿和黃酮類等?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)枸杞具有清肝明目、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等功效[9]。

果醋是以一種或多種水果、果渣為原料，經(jīng)現(xiàn)代生物技術(shù)釀造而成的飲料，其中含有多種有機酸，營養(yǎng)價值豐富，具有維持人體酸堿平衡，促進血液循環(huán)，抗菌消炎等功效[10]。本試驗以山藥和枸杞為原料，用紅茶菌混合發(fā)酵制備復(fù)合型果醋，既延長了原料在室溫下的保存時間，又改善了原料的感官特性，同時增加了其營養(yǎng)價值和保健功能。此外，采用Box-Benhnken響應(yīng)面法對發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，這也為山藥枸杞復(fù)合型果醋的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅茶菌混合菌種：安徽九州神龍生物科技有限公司；山藥、枸杞、紅茶、白糖：均購于大潤發(fā)超市。

α-淀粉酶(≥4000 U)、糖化酶(≥100000 U)：均購于上海源葉生物科技有限公司；酚酞、乙醇、氫氧化鈉等：均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-50A型立式壓力蒸汽滅菌鍋、LH-CNT65數(shù)顯糖度計、PHSJ-4A型pH計、L550 型離心機、DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱、HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋、JP728型榨汁機。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅茶菌液的制備

稱取5.0 g紅茶加入500 mL沸水中，于85～90 ℃保持10 min，過濾得紅茶汁，然后加入白砂糖100 g，混勻得茶糖水，冷卻至室溫。向茶糖水中加入40%的紅茶菌母液，存放于滅菌的玻璃容器中，用雙層紗布封口，然后放置在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵7 d，待液面產(chǎn)生薄膜即可得到紅茶菌菌液[11]。

1.3.2 工藝流程

1.3.3 操作要點

1.3.3.1 枸杞汁的制備

挑選肉厚、無腐爛、無霉變褐變的寧夏枸杞。用流動水多次沖洗枸杞表面的灰塵或污物。清洗后的枸杞在40～50 ℃水中浸泡30 min。浸泡好的枸杞放入榨汁機中，按照1∶5 (g/mL)的比例加水，進行破碎打漿。將枸杞漿料壓榨使渣滓分離得濾液，渣料加2倍水于水浴鍋中浸提2次，濾液同浸提液混合得枸杞汁。

1.3.3.2 山藥汁的制備

挑選新鮮無蟲害、無霉?fàn)€、無機械損傷的淮山藥，用流動水沖洗干凈，刮刀去表皮，切成10～15 cm的山藥段，立即放入90～95 ℃的熱水中，熱燙5 min，鈍化酶的活性。山藥段撈出放涼，切成2～3 mm的山藥片。將山藥片按照1∶3 (g/mL)的比例加水，再添加0.05%的異抗壞血酸鈉進行護色處理30 min。護色后的山藥經(jīng)清水漂洗后，放入榨汁機中，按照1∶5 (g/mL)的比例加水，制備山藥漿。將山藥漿置于90～95 ℃的水浴鍋中糊化30 min，冷卻至55 ℃時加入0.05 mg/g的α-淀粉酶進行恒溫酶解3 h，然后采用1%的檸檬酸將山藥漿液的pH調(diào)至5.0，加入0.1 mg/g的糖化酶進行55 ℃恒溫酶解2 h，最后將山藥漿液加熱至95 ℃保持10 min，進行滅酶處理，過濾到山藥汁[12]。

1.3.3.3 調(diào)配混勻

將制備好的山藥汁、枸杞汁按照體積比5∶3進行混合，用1%的檸檬酸鈉將混合液的pH調(diào)至4.5，并調(diào)節(jié)其至適宜的初始糖度。

1.3.3.4 高溫滅菌

調(diào)配混勻后的山藥枸杞混合液在高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌15 min，冷卻備用。

1.3.3.5 紅茶菌的接種與發(fā)酵

將冷卻后的山藥枸杞混合液接入活化后的紅茶菌中，放入恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵5 d，若時間再延長，會產(chǎn)生其他代謝產(chǎn)物，使果醋口味發(fā)生不良變化。

1.3.3.6 澄清

用1%殼聚糖對山藥枸杞果醋進行澄清。用量為果醋總量0.5%，靜置1.5 h。

1.3.3.7 殺菌

將制備好的山藥枸杞果醋放于合適的包裝瓶中，封好后進行巴氏殺菌。

1.3.4 山藥枸杞汁最佳配比的確定

依次將山藥汁與枸杞汁按照7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7的配比混合均勻，結(jié)合上述工藝流程及操作要點，調(diào)整山藥枸杞的初始糖度為18%，紅茶菌接種量為16%，發(fā)酵溫度為30 ℃，在恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵5 d，制得山藥枸杞復(fù)合果醋，利用感官評價指標(biāo)確定山藥枸杞汁的最佳配比。

1.3.5 果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

取上述處理好的山藥枸杞汁(以其總量計)，在紅茶菌接種量為12%、16%、20%、24%、28%，初始糖度為14%、16%、18%、20%、22%，發(fā)酵溫度為22，26，30，34，38 ℃的條件下發(fā)酵5 d進行單因素試驗，研究這3個因素對果醋發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響。

1.3.6 果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取紅茶菌接種量、初始糖度、發(fā)酵溫度為考察因素，總酸含量為響應(yīng)值，運用Box-Benhnken試驗設(shè)計對山藥枸杞果醋發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，各因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平Table 1 The factors and levels of response surface test

1.3.7 分析檢測方法

1.3.7.1 感官評價

取山藥枸杞果醋2 mL于25 mL具塞比色管中，加水至刻度，振搖，觀察色澤。取山藥枸杞果醋30 mL于50 mL燒杯中觀察狀態(tài)。用玻璃棒攪拌，品嘗滋味，聞其氣味。參照GB/T 18187—2000《釀造食醋》中的感官指標(biāo)要求，從色澤、滋味和氣味、狀態(tài)3個方面對果醋進行感官評價。

1.3.7.2 理化指標(biāo)的測定

總酸含量測定：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法，以醋酸(g/dL)計。

可溶性固形物含量測定：參照NY/T 2637—2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的測定 折射儀法》。

1.3.7.3 微生物指標(biāo)的測定

菌落總數(shù)及大腸菌群測定：參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并繪制圖表，用Design Expert 11進行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥枸杞汁最佳配比

由不同配料比混勻的山藥枸杞汁在一定的初始糖度和溫度下，由紅茶菌發(fā)酵而成的果醋的感官評價，見表2。

表2 山藥-枸杞最佳配比的感官評價Table 2 The sensory evaluation of the optimal ratio of Chinese yam to Lycium barbarum

由表2可知，當(dāng)山藥汁與枸杞汁的配比為4∶6時，色澤、滋味和氣味及狀態(tài)最符合感官要求。因此，選用山藥汁與枸杞汁的配比為4∶6。

2.2 山藥枸杞果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.2.1 紅茶菌接種量對果醋總酸含量的影響

在初始糖度18%、發(fā)酵溫度30 ℃的條件下，研究不同紅茶菌接種量對山藥枸杞果醋發(fā)酵產(chǎn)酸的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 紅茶菌接種量對果醋總酸含量的影響Fig.1 Effect of Kombucha inoculation amount on the total acid content of fruit vinegar

由圖1可知，隨著紅茶菌接種量的增大，果醋總酸含量呈現(xiàn)先增長后緩慢下降的趨勢。這是由于隨著接種量不斷增加，菌體會出現(xiàn)大量增殖，一方面會生成大量的代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致細胞過早老化、自溶等現(xiàn)象，另一方面，菌體大量繁殖所需營養(yǎng)物質(zhì)含量減少，從而導(dǎo)致果醋總酸含量下降[13]。因此，選擇合適的紅茶菌接種量有利于控制菌種密度和總酸含量，最佳接種量為16%。

2.2.2 初始糖度對果醋總酸含量的影響

在紅茶菌接種量16%、發(fā)酵溫度30 ℃的條件下，研究不同初始糖度對山藥枸杞果醋發(fā)酵產(chǎn)酸的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 初始糖度對果醋總酸含量的影響Fig.2 Effect of initial sugar content on the total acid content of fruit vinegar

由圖2可知，隨著初始糖度的增加，果醋總酸含量先增大后減小。這是由于足夠的碳源可以使得菌體生長代謝產(chǎn)生豐富的有機酸和其他有益成分，但初始糖度過大，即混合液的滲透壓過大，會導(dǎo)致菌體細胞脫水引起質(zhì)壁分離，從而不利于其生長與發(fā)酵[14-15]。因此，要選擇合適的初始糖度，太高或太低都不利于其發(fā)酵，最佳初始糖度為18%。

2.2.3 發(fā)酵溫度對果醋總酸含量的影響

在紅茶菌接種量16%、初始糖度18%的條件下，研究不同發(fā)酵溫度對山藥枸杞果醋發(fā)酵產(chǎn)酸的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對果醋總酸含量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the total acid content of fruit vinegar

由圖3可知，隨著溫度的上升，果醋總酸含量先上升后下降。溫度是影響微生物生長與發(fā)酵的重要因素。當(dāng)溫度升高時，微生物細胞內(nèi)的酶活性提高，反應(yīng)加快，產(chǎn)酸較高；但溫度過高時，細胞內(nèi)酶失活，不利于微生物生長，從而產(chǎn)酸較少。因此，紅茶菌發(fā)酵的最佳溫度為30 ℃。

2.3 響應(yīng)面試驗

2.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果及因素交互

根據(jù)單因素試驗結(jié)果及表1中試驗因素水平編碼設(shè)計進行Box-Benhnken試驗設(shè)計，結(jié)果見表3，回歸模型方差分析見表4。

表3 Box-Benhnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Box-Benhnken test design and results

運用軟件Design-Expert 11對表3中試驗結(jié)果進行多元二次回歸擬合，得到總酸含量(Y)與紅茶菌接種量(A)、初始糖度(B)、發(fā)酵溫度(C)的回歸方程：Y=4.62+0.2738A+0.0863B+0.1100C-0.0725AB-0.0600AC+0.1050BC-0.4773A2-0.2523B2-0.7297C2。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis for regression model

由表4可知，該模型影響極顯著(P<0.0001)，回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9863，決定系數(shù)(調(diào)整相關(guān)系數(shù))RAdj2=0.9688，能在96.88%的變化范圍內(nèi)解釋響應(yīng)值的變化，且失擬項不顯著(P=0.2535>0.05)，說明該模型擬合程度好，誤差不大，適用于山藥枸杞果醋發(fā)酵工藝的優(yōu)化。

此外，在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，A、A2、B2、C2所對應(yīng)的P值均小于0.01，說明這幾個因素對結(jié)果有極顯著影響；B，C所對應(yīng)的P值均小于0.05，說明這兩個因素對結(jié)果有顯著影響；交互項AB、AC、BC所對應(yīng)的P值均大于0.05，說明各因素之間有一定的交互作用，但交互不顯著。同時根據(jù)F值的大小可以得出3個因素對結(jié)果影響的主次順序為A>C>B，即紅茶菌接種量>發(fā)酵溫度>初始糖度。

2.3.2 優(yōu)化工藝確定和驗證試驗

經(jīng)響應(yīng)面回歸分析得到的最優(yōu)發(fā)酵工藝為紅茶菌接種量17.08%，初始糖度18.29%，發(fā)酵溫度30.30 ℃，在此條件下山藥枸杞果醋總酸含量的理論值達到4.67 g/dL。根據(jù)實際的試驗條件，將最佳工藝條件調(diào)整為紅茶菌接種量17%，初始糖度18%，發(fā)酵溫度30 ℃。在最佳條件下進行了3次驗證試驗，果醋總酸含量的平均值為4.65 g/dL，與理論預(yù)測值的相對誤差較小，表明Box-Benhnken設(shè)計響應(yīng)面法得到的發(fā)酵工藝是可信的。

2.4 山藥枸杞果醋的質(zhì)量指標(biāo)

2.4.1 感官指標(biāo)

色澤：淡紅色；氣味：具有果醋的特殊風(fēng)味，氣味純正；滋味：酸甜適中，濃郁醇香，無異味；狀態(tài)：澄清透亮，穩(wěn)定均勻，無沉淀，無雜質(zhì)。該果醋具有山藥和枸杞的果香和醋香，其感官指標(biāo)符合GB/T 18187—2000《釀造食醋》中的要求。

2.4.2 理化指標(biāo)

總酸(以醋酸計)：4.65 g/dL；可溶性固形物含量為2.2%，符合GB/T 18187—2000《釀造食醋》中的具體要求。

2.4.3 微生物指標(biāo)

菌落總數(shù)≤100 CFU/mL；大腸桿菌及其他致病菌未檢出，該指標(biāo)符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

以山藥和枸杞為原料，利用紅茶菌中的酵母菌、醋酸菌和乳酸菌等共生物協(xié)同對山藥枸杞混合汁進行發(fā)酵，制備山藥枸杞果醋。山藥汁與枸杞汁的配比為4∶6，控制初始糖度為18%，紅茶菌接種量為17%，于30 ℃條件下發(fā)酵5 d，得到果醋成品，總酸含量為4.65 g/dL。此工藝條件簡單，易于控制，制得山藥枸杞果醋的感官、理化和微生物指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)，且具有良好的風(fēng)味。