郭艷霞，賈麗艷,2*，暢盼盼,2，張麗,2，周士琦,2

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801；2.山西省白酒生物工程研究所教育創(chuàng)新中心，山西 晉中 030801)

蛋白酶能催化肽鍵水解成氨基酸或短肽的酶類，廣泛存在于動物、植物和微生物中[1]， 是工業(yè)化酶制劑中應用最為廣泛的酶制劑之一；蛋白酶根據(jù)初始pH進行分類，分為中性蛋白酶、酸性蛋白酶和堿性蛋白酶。中性蛋白酶作為一種生物催化劑，作用底物廣泛，主要應用于食品工業(yè)、皮革加工、紡織、化妝品等行業(yè)[2-3]，而且其反應條件溫和，是目前蛋白質(zhì)水解處理的重要酶種，近年來更發(fā)展出許多新的用途[4-6]，比如在焙烤食品和飲料澄清等方面都起著重要的作用，它可以縮短奶酪的老熟期[7-8],消除果汁中的沉淀而且增加果汁中可溶性固形物的含量[9]。蛋白酶的活性容易受到客觀條件的影響，如在常溫保存和應用過程中通常會出現(xiàn)不穩(wěn)定情況，尤其在強酸、強堿及高滲等極端條件下容易失活，這些條件限制了蛋白酶的廣泛應用。因此，如何研發(fā)新型、對環(huán)境耐受性強的中性蛋白酶，成為目前工業(yè)生產(chǎn)亟需解決的問題。

貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)是芽孢桿菌屬中一種新興的功能性菌種[10-12]，革蘭氏陽性，具有分泌多種酶(如纖維素酶、蛋白酶等[13])的能力，被廣泛應用于食醋釀造、其他食品發(fā)酵及農(nóng)業(yè)領域[14]。課題組前期從高溫大曲中分離獲得的一株耐高溫貝萊斯芽孢桿菌YB19(簡稱菌株YB19)，該菌株具有產(chǎn)耐高溫中性蛋白酶的能力[15]。本文以菌株YB19為研究對象，以麩皮為發(fā)酵基質(zhì)，通過單因素及響應面法優(yōu)化產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵條件，為該菌株以及所產(chǎn)蛋白酶的開發(fā)應用奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

貝萊斯芽孢桿菌YB19：山西農(nóng)業(yè)大學生物工程實驗室提供。

種子培養(yǎng)基：酵母膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min[16]。

發(fā)酵用培養(yǎng)基：麩皮12 g，豆粕粉3 g，水15 mL，pH自然，121 ℃滅菌30 min。

1.1.2 試劑

NaCl(分析純)：天津市鼎盛鑫化工有限公司；胰蛋白胨：北京維百奧生物科技有限公司；干酪素(分析純)：天津市登峰化學試劑廠；酵母膏、福林酚(分析純)：北京索萊寶科技有限公司；三氯乙酸、Na2CO3、NaOH(分析純)：天津市科密歐化學試劑有限公司；乳酸(分析純)：天津市風船化學試劑科技有限公司；乳酸鈉：天津市光復精細化工研究所；Na2HPO3、NaH2PO3(分析純)：天津市恒興化學試劑制造有限公司；麩皮、豆粕粉：太谷縣農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 儀器與設備

V-1300型可見分光光度計 上海美析儀器有限公司；HC5002電子天平 慈溪市華徐衡器實業(yè)有限公司；H4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；SW-CJ-1D型凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；DHP-9032型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；ZWY-1102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)及發(fā)酵條件

將活化的菌株YB19以3%的接種量接種于種子培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h作為種子液。將種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵用培養(yǎng)基中，在不同條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3.2 中性蛋白酶活力測定

稱取4 g發(fā)酵培養(yǎng)基，加pH 7.2磷酸緩沖液20 mL，40 ℃恒溫浸提30 min，按照GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑》蛋白酶活性的測定方法對高產(chǎn)蛋白酶菌株的蛋白酶活力進行測定[17]。

1.3.3 設計單因素對中性蛋白酶活力影響的試驗

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的基礎上，研究發(fā)酵時間(12，24，48，72，96 h)、發(fā)酵溫度(27，32，37，42，47 ℃)、接種量(1%、1.5%、2%、3%、5%)、水分含量(5，10，15，25，35 mL)、豆粕粉含量(10%、15%、20%、25%、30%)對中性蛋白酶活力的影響，從而確定最佳發(fā)酵條件。

1.3.4 Plackett-Burman(PB)試驗

依據(jù)單因素試驗的結(jié)果，對影響菌株YB19產(chǎn)中性蛋白酶能力的5個因子(發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量、水分含量、豆粕含量)進行PB試驗，試驗設計見表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素與水平 Table 1 The factors and levels of Plackett-Burman test

1.3.5 響應面優(yōu)化試驗

以單因素和PB試驗結(jié)果為基礎，采用三因素三水平的Box-Behnken響應而試驗設計法，以發(fā)酵時間、接種量和水分含量為自變量，以中性蛋白酶的酶活為指標進行優(yōu)化，用Design-Expert 8.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析。響應面試驗因素與水平見表2。

表2 響應面試驗因素與水平Table 2 The factors and levels of response surface test

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵時間對菌株YB19產(chǎn)中性蛋白酶能力的影響

考察不同發(fā)酵時間對菌株YB19產(chǎn)中性蛋白酶能力的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)YB19中性蛋白酶能力的影響Fig.1 Effect of fermentation time on neutral protease activity produced by Bacillus velezensis YB19

由圖1可知，起初中性蛋白酶活力隨著時間的延長呈現(xiàn)上升趨勢，24 h時活力最高，為364.54 U/g，之后反而逐漸下降，可能是因為隨著時間的延長，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分逐漸耗盡，并且積累了很多次級代謝產(chǎn)物，抑制了該菌株產(chǎn)中性蛋白酶活力，培養(yǎng)時間為96 h時中性蛋白酶活力最低。結(jié)果表明，當發(fā)酵時間為24 h時，菌株YB19產(chǎn)中性蛋白酶能力最強。

2.1.2 發(fā)酵溫度對菌株YB19產(chǎn)中性蛋白酶能力的影響

研究不同發(fā)酵溫度對菌株YB19產(chǎn)中性蛋白酶能力的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對菌株YB19產(chǎn)中性蛋白酶能力的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on neutral protease activity produced by Bacillus velezensis YB19

由圖2可知，溫度為32 ℃時中性蛋白酶活力最高，之后隨著溫度的升高，中性蛋白酶活力開始降低，溫度在37～47 ℃之間，中性蛋白酶活力相對比較穩(wěn)定，所以選擇32 ℃作為后續(xù)試驗的發(fā)酵溫度。結(jié)果表明，當發(fā)酵溫度為32 ℃時，菌株YB19產(chǎn)中性蛋白酶能力最強。

2.1.3 接種量對菌株YB19產(chǎn)中性蛋白酶能力的影響

選擇5種不同的接種量，經(jīng)發(fā)酵后測定中性蛋白酶活力，結(jié)果見圖3。

圖3 接種量對菌株YB19產(chǎn)中性蛋白酶能力的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on neutral protease activity produced by Bacillus velezensis YB19

由圖3可知，當接種量為3%時，中性蛋白酶酶活力高達364.4 U/g，與1%時的中性蛋白酶酶活力相比增加58%，但接種量為5%時，中性蛋白酶活力反而下降。這可能是因為發(fā)酵初期菌體迅速生長，營養(yǎng)物質(zhì)消耗速度快，并產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物及有毒物質(zhì)，抑制菌體后期生長，導致酶活降低[18]。因此，選擇3%為最佳接種量。結(jié)果表明，當接種量為3%時，菌株YB19產(chǎn)中性蛋白酶能力最強。

2.1.4 水分含量對菌株YB19產(chǎn)中性蛋白酶能力的影響

圖4 水分含量對菌株YB19產(chǎn)中性蛋白酶能力的影響Fig.4 Effect of water content on neutral protease activity produced by Bacillus velezensis YB19

由圖4可知，菌株YB19產(chǎn)中性蛋白酶活力隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中水分含量的增加而增大，當水分含量為15 mL時中性蛋白酶活力最高，為363.46 U/g。此后，水分含量再增加反而抑制了該菌株產(chǎn)中性蛋白酶活力。所以，發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳水分含量為15 mL。結(jié)果表明，當水分含量為15 mL時，菌株YB19產(chǎn)中性蛋白酶能力最強。

2.1.5 豆粕含量對菌株YB19產(chǎn)中性蛋白酶能力的影響

選擇豆粕粉為發(fā)酵用培養(yǎng)基中的氮源，考察不同添加量對貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶活力的影響，見圖5。

圖5 豆粕含量對菌株YB19產(chǎn)中性蛋白酶能力的影響Fig.5 Effect of soybean meal content on neutral protease activity produced by Bacillus velezensis YB19

由圖5可知，該菌株產(chǎn)中性蛋白酶活力隨著培養(yǎng)基中豆粕粉含量的增加先升高后降低，當豆粕含量為20%時，中性蛋白酶活力最高，為363.98 U/g。當豆粕粉含量大于20%時中性蛋白酶活力反而降低，可能是由于發(fā)酵過程中分解氮源產(chǎn)生了肽類化合物，競爭性抑制了蛋白酶的活力。結(jié)果表明，當豆粕粉含量為20%時，菌株YB19產(chǎn)中性蛋白酶能力最強。

2.2 Plackett-Burman(PB)試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，利用PB試驗對發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量、水分含量和豆粕含量5個因素進行顯著因子的篩選，分12組，試驗設計見表3。

表3 Plackett-Burman試驗設計及結(jié)果 Table 3 Plackett-Burman test design and results

表4 Plackett-Burman試驗方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman test

由表4可知，P(A發(fā)酵時間)=0.033，P(C接種量)=0.002，P(D水分含量)=0.025，均小于0.05，影響顯著。所以選擇發(fā)酵時間、接種量和水分含量進行進一步響應面優(yōu)化試驗設計。

2.3 響應面試驗設計及結(jié)果

根據(jù)單因素及Plackett-Burman(PB)試驗結(jié)果，以發(fā)酵時間、接種量、水分含量3個因素為變量，以中性蛋白酶活力為響應值(Y)，進行響應面優(yōu)化試驗，試驗設計及結(jié)果見表5。

表5 響應面試驗設計及結(jié)果Table 5 The response surface test design and results

2.3.1 構建數(shù)學模型及模型檢驗

采用Design-Expert 8.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，構建數(shù)學模型。通過對該模型進行方差分析，得到3個因素多元線性回歸方程為：Y=366.74-26.38X1-14.97X2+20.22X3-3.36X1X2-14.47X1X3+19.96X2X3-117.84X12-79.80X22-131.76X32。對該模型進行顯著性檢驗，回歸模型方差分析見表6。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance of regression model

續(xù) 表

由表6可知，模型的P>F，P<0.0001，表明模型方程極顯著，說明驗證方法可行可靠；失擬項P=0.094>0.05，差異不顯著，表明該回歸方程的擬合度較好，能很好地反映檢測過程中各種因素和中性蛋白酶(Y)之間的準確關系，能夠利用回歸方程得出最佳的發(fā)酵條件；模型的回歸決定系數(shù)R2=0.9965，表明有99.65%的響應值變化是因為所選擇的因素。二次項X12、X22、X32對Y有極顯著影響，而一次項X1、X2、X3對Y的影響極顯著(P<0.01)；交互項X1X3對Y的影響顯著(P<0.05)，X2X3對Y的影響極顯著(P<0.01)，而X1X2對Y的影響不顯著。由F值可知，各因素對貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶活力的影響次序為X1>X3>X2。

由Design-Expert 8.0得出該菌株產(chǎn)中性蛋白酶活力的最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵時間為28 h，接種量為3.4%，水分含量為18 mL，其相對酶活力達到369.66 U/g。

2.3.2 貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶活力發(fā)酵條件優(yōu)化響應面圖及等高線圖

響應面分析及等高線見圖6(圖6中的A，B，C分別代表X1、X2、X3)。響應面及其等高線的形狀可直觀地反映各因素間的交互作用對中性蛋白酶活性的影響[19]。

圖6 發(fā)酵時間、接種量和水分含量交互作用對中性蛋白酶活力影響的響應面及等高線圖Fig.6 The response surface plots and contour lines of effects of interaction between fermentation time, inoculation amount and water content on neutral protease activity

由圖6可知，AC、BC之間的交互作用顯著，響應面等高線走勢較陡，具有明顯的最高點；AB的交互作用不顯著，響應面等高線走勢較平緩。

2.3.3 驗證試驗

為驗證響應面試驗所得結(jié)果的可靠性，對通過響應面試驗得出的最佳發(fā)酵條件進行3次平行試驗，測得中性蛋白酶活力為(370.03±1.56) U/g，與預測值(369.66±1.03) U/g相當接近，因此得到的模型能夠較好預測實際中性蛋白酶活力，所以響應面法適用于貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶活力研究。

3 結(jié)論

在單因素的基礎上，采用響應面法對貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶活力的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，產(chǎn)中性蛋白酶的最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵時間為28 h，發(fā)酵溫度為32 ℃，接種量為3.4%，水分含量為18 mL，豆粕粉含量為20%。在此條件下，進行了驗證試驗，結(jié)果測得中性蛋白酶活力均值為(370.03±1.56) U/g。以上研究為貝萊斯芽孢桿菌YB19后期產(chǎn)酶機理、酶學性質(zhì)研究及在食醋釀造中的應用奠定了理論基礎。