萬陜寧,黨穎慧,鄭蕓蕓,宋婷婷,張建芳,李 佳,楊 紅

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710032;*通訊作者,E-mail:yanghonhfck@163.com)

6p21微缺失綜合征也稱顱骨鎖骨發(fā)育不良綜合征(cleidocranial dysplasia CCD;OMIM 119600)是一種罕見的常染色體顯性遺傳的骨骼發(fā)育不良綜合征,主要臨床特征是前額和頂葉突出、短頭畸形、顱縫閉合較晚、發(fā)育不全或鎖骨再生不全、多種牙齒異常和身材矮小等。染色體微陣列分析技術(shù)(chromosomal microarray-based analysis,CMA)可用于全基因組水平的拷貝數(shù)分析,不僅可以快速有效地檢測常規(guī)核型分析的染色體不平衡變異,而且可以檢測整個基因組的微缺失和微重復(fù)。與常規(guī)G顯帶核型分析相比,CMA具有高分辨率、高敏感性、快速準(zhǔn)確、易于自動化等優(yōu)點。本文報道1例聯(lián)合應(yīng)用常規(guī)G顯帶核型分析和CMA技術(shù)進行檢測,發(fā)現(xiàn)6p21微缺失病例,并探討其臨床表現(xiàn)和發(fā)病機制。

1 病例資料

1.1 臨床資料

孕婦,33歲,G3P1A1,孕26周,生育過一個健康孩子,人工流產(chǎn)一次。孕婦平素月經(jīng)規(guī)則,孕期順利,無特殊不適。無抽煙、嗜酒史,無胎兒畸形家族史。否認近親結(jié)婚,否認輔助生殖。孕早期B超提示胎兒頸后透明層(NT)值1.6 mm,無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果為低風(fēng)險。因孕中期B超提示胎兒顱骨欠規(guī)則,顱骨部分回聲減弱,顱內(nèi)腦回,腦溝減少,變淺,胎兒鼻骨顯示不清,來本科室就診。

1.2 檢測方法

1.2.1 G顯帶核型分析 超聲下進行羊膜腔穿刺術(shù)抽取孕婦羊水20 ml,取10 ml標(biāo)本進行羊水細胞培養(yǎng),按常規(guī)方法制片,G顯帶分析。顯微鏡下計數(shù)20個中期分裂相,分析5個細胞核型,對異常核型增加分析數(shù),根據(jù)人類細胞遺傳學(xué)國際(ISCN2016)命名體制描述染色體異常核型。

1.2.2 CMA檢測 取10 ml羊水標(biāo)本進行基因組DNA提取,使用QIAGEN公司生產(chǎn)的QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒,嚴格按照試劑盒說明書進行。應(yīng)用美國Affymetrix公司生產(chǎn)的Affymetrix CytoScan 750k基因芯片進行CMA檢測,實驗過程包括酶切、連接、PCR擴增、片段化、標(biāo)記、芯片雜交、洗染和掃描。使用Chromosome Analysis Suite(ChAS; version2.1)軟件對芯片掃描的數(shù)據(jù)進行分析,參照數(shù)據(jù)庫DECIPHER(http://decipher.sanger.ac.uk/)、OMIM(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)、DGV(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbvar/)、UCSC(http://genome.ucsc.edu)、PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)等進行結(jié)果分析。檢測結(jié)果拷貝數(shù)變異CNV(Copy number variations)分為致病性CNV、可能致病CNV、臨床意義不明CNV、可能良性CNV和良性CNV。

1.3 檢測結(jié)果

染色G顯帶結(jié)果顯示核型結(jié)果為46,XY(見圖1),核型無明顯異常。而CMA分析發(fā)現(xiàn)染色體6p21.1位置arr[hg19]6p21.1(44,032,138-45,486,795)x1發(fā)生1.45 Mb的缺失(見圖2),查詢數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)該區(qū)域為致病性CNV,該區(qū)域位置包含了19個OMIM基因(見圖3),包括RUNX2(OMIM119600;600211),VEGFA(OMIM 192240),NFKBIE(OMIM 604548)等,其中綠色基因為致病基因。

2 討論

顱骨鎖骨發(fā)育不良綜合征(cleidocranial dysplasia CCD;OMIM 119600)是一種罕見的骨骼疾病,屬于常染色體顯性遺傳,具有特征性的臨床表現(xiàn)。CCD是以顱面骨異常為主的全身各處骨骼系統(tǒng)廣泛受累的先天性骨發(fā)育疾病[1,2],其特異的臨床表現(xiàn)主要有:鎖骨缺如,或發(fā)育不全,顱部囟門張開和延遲閉合,牙齒萌出異?；蚨嗌?全身其他臨床特征還可表現(xiàn)為:面中部發(fā)育不足,圓錐狀胸廓,肩胛骨小,骨盆發(fā)育不全,恥骨聯(lián)合間隙增寬,身材矮小等。特殊臨床表現(xiàn)還涉及腦異常包括回腦小,胼胝缺如,結(jié)構(gòu)錯亂以顳葉及小腦為著。胎兒期伴羊水過多等癥狀。

圖3 染色體6p21區(qū)域包含的基因(綠色為明確致病基因)

本例患者羊水穿刺核型分析結(jié)果正常,CMA檢測發(fā)現(xiàn)6p21位置發(fā)生1.45 Mb缺失,該區(qū)域包含19個OMIM基因,查閱數(shù)據(jù)庫DECIPHER、OMIM、DGV、UCSC后,分析發(fā)現(xiàn)該片段區(qū)域功能性基因的缺失可導(dǎo)致患者出現(xiàn)6p21缺失綜合征,即CCD。而孕婦孕中期B超提示顱骨欠規(guī)則,顱骨部分回聲減弱,顱內(nèi)腦回、腦溝減少,變淺等癥狀與文獻報道[1,2]的CCD臨床表現(xiàn)相似。

通過檢索文獻發(fā)現(xiàn)基因RUNX2是CCD的主要致病基因,位于6號染色體短臂6p21,為主要的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子,控制著前體細胞向成骨細胞的分化,是膜性和軟骨內(nèi)骨形成的關(guān)鍵[3]。它被稱為骨骼發(fā)育的主基因[4]。在報道的CCD病例中,大約60%-70%的病例存在RUNX2突變,約13%的病例存在涉及RUNX2和相鄰基因的微缺失[5],至少有62種RUNX2突變已經(jīng)在CCD患者中被發(fā)現(xiàn)[6,7]。RUNX2基因是RUNX轉(zhuǎn)錄因子家族的一員,編碼具有Runt結(jié)構(gòu)域的核蛋白,該蛋白是成骨細胞分化和骨骼形態(tài)發(fā)生所必需的,并作為骨架基因表達所涉及的核酸和調(diào)控因子的支架。這種蛋白質(zhì)既可以作為單體結(jié)合DNA,也可以作為異二聚體復(fù)合物的亞基結(jié)合DNA(親和力更強)。編碼蛋白的N端區(qū)域存在兩個潛在的三核苷酸重復(fù)擴增區(qū)域,該基因中的這些和其他突變都與骨發(fā)育障礙有關(guān)。因此,CCD的特點是全身骨骼發(fā)育不良,尤其是異常的鎖骨、未閉合的顱骨縫合線和骨間窩、多余的牙齒、矮小的身材以及其他各種骨骼變化。阿根廷的一份報告稱,在對37例病例研究中,發(fā)現(xiàn)95%有顱骨異常,75%有單鎖骨改變,100%有雙側(cè)鎖骨改變[8]。

此外,6p21上除RUNX2以外的基因的單倍體不充分也可能是造成發(fā)育遲緩和傷口愈合不良的表型[9]?；騐EGFA(OMIM 192240),位于6p21,編碼血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA),它是血管內(nèi)皮細胞的血管生成調(diào)節(jié)因子,VEGFA刺激上皮細胞的增殖、血管的形成和內(nèi)皮細胞的存活。缺乏VEGFA可能導(dǎo)致血管生成不良和血管外重構(gòu),從而影響傷口愈合?；騈FKBIE(OMIM 604548),位于6p21,編碼NF-kappa-B抑制劑,NFKBIE的缺乏可能導(dǎo)致感染和炎癥的易感性,并導(dǎo)致傷口愈合不良[10]。因此,幼兒期的患兒由于骨化缺陷,頭部外傷后易發(fā)生腦損傷,傷口愈合不良等情況,如有需要,可提供防護頭盔,隨時觀察孩子的生長發(fā)育情況,進行相應(yīng)的保護措施[11]。

綜上所述,我們對1例孕中期B超提示異常的孕婦進行了產(chǎn)前診斷,胎兒的診斷結(jié)果為顱骨鎖骨發(fā)育不良綜合征,對本例孕婦夫妻雙方進行CMA檢測驗證,發(fā)現(xiàn)胎兒的缺失為新發(fā)的,而且孕后期B超提示CCD癥狀明顯,此家庭最終選擇終止妊娠。我們對CCD的臨床表現(xiàn)及發(fā)病機制進行了分析,為此類疾病的遺傳咨詢提供了依據(jù),也有助于對癥狀輕微的胎兒出生后的表型進行初步估計,對于患兒及其后的治療和隨訪有重要的意義。對于傳統(tǒng)細胞遺傳學(xué)檢測方法而言,CMA是一個很好的完善和補充,尤其是針對染色體微缺失或微重復(fù)的產(chǎn)前診斷病例,染色體微陣列分析技術(shù)的優(yōu)越性得到體現(xiàn)。對于臨床表現(xiàn)特殊,常規(guī)G顯帶核型分析未見異常的患者,更應(yīng)建議進一步的CMA檢測。