周嬋 姜林輝 盧碧燕 冼麗英 袁錦玉

1)南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞醫(yī)院 東莞 523000 2)廣東東莞職業(yè)技術(shù)學(xué)院 東莞 523000

結(jié)直腸癌是危害人類健康的常見惡性腫瘤之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織下屬的國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)(GLOBOCAN 2020)，預(yù)計2020年全球新增結(jié)直腸癌患者約193萬，死亡人數(shù)約93.5萬[1]。早期結(jié)直腸癌患者的預(yù)后相對較好，但是對于中晚期患者，即使接受手術(shù)、放化療、新型靶向及免疫治療，5 a生存率仍僅為50%～60%。結(jié)直腸癌的發(fā)生和進展是一個復(fù)雜的病理過程，涉及多種信號通路的調(diào)節(jié)。微小RNA(microRNA)屬于內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，與人類多種疾病密切相關(guān)[2-3]。本研究擬檢測microRNA-192在結(jié)直腸癌、腺瘤和增生型息肉中的表達情況，探討其與結(jié)直腸癌的臨床病理因素的相關(guān)性，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)microRNA-192的表達，觀察腸癌細(xì)胞株增殖和遷移能力變化。

1 資料與方法

1.1一般資料收集我院2010-01—2014-12病理科存檔的結(jié)直腸癌標(biāo)本45例，腺瘤25例，增生性息肉25例。所有入組的結(jié)直腸癌病例臨床資料完整，術(shù)前均未行放化療、靶向或免疫治療，并經(jīng)組織病理學(xué)證實為浸潤性腺癌。結(jié)直腸癌的分期參照美國癌癥聯(lián)合委員會和國際抗癌聯(lián)盟共同制訂的結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)(2010年第七版)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2方法熒光定量PCR檢測microRNA-192的表達：常規(guī)切片蘇木素-伊紅染色，在顯微鏡下選取代表性區(qū)域，8 μm厚度切片5張。使用北京天根生物科技有限公司生產(chǎn)的石蠟包埋組織切片總RNA提取試劑盒(DP439)提取總RNA。根據(jù)miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)條件：95 ℃起始模板變性15 min，94 ℃變性20 s，60 ℃退火延伸34 s，共45個循環(huán)。通過熔解曲線對擴增產(chǎn)物進行分析并相對定量。CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況：將各組細(xì)胞以1×105/孔的濃度分別接種于96孔板，每組設(shè)5個復(fù)孔，在不同時間點加入CCK-8工作液(10 μL/孔)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱避光繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用Model 680酶標(biāo)儀在波長450 nm處測定吸光度值。Transwell小室裝置檢測細(xì)胞遷移能力：化學(xué)合成microRNA-192模擬物及陰性對照，利用LipofectamineTM 3 000試劑進行轉(zhuǎn)染。各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48 h后使用胰酶消化，并用無血清培養(yǎng)基重懸制成1×105/mL的細(xì)胞懸液，取200 μL加入上室，在下室中加入800 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)36 h，去除上室細(xì)胞，用4%甲醛固定10 min，臺盼藍染色，顯微鏡下隨機選取5個400倍視野計算遷移細(xì)胞數(shù)目。

2 結(jié)果

2.1microRNA-192在不同組織中的表達情況熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，microRNA-192在結(jié)直腸癌中的表達水平低于結(jié)直腸腺瘤和增生性息肉(P<0.05)。見圖1。

圖1 microRNA-192對腸癌細(xì)胞株LoVo增殖和遷移能力的影響

2.2microRNA-192表達與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性在45例結(jié)直腸癌患者中，microRNA-192的表達水平與是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)；而與患者的年齡、性別、腫瘤分級等無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

2.3microRNA-192對腸癌細(xì)胞增殖和遷移的影響CCK-8試劑盒和Transwell小室裝置分別檢測細(xì)胞增殖活性和遷移能力，結(jié)果顯示，microRNA-192對人腸癌細(xì)胞株LoVo的生長和遷移均具有抑制作用(P<0.05)。見圖2、圖3。

圖2 microRNA-192對腸癌細(xì)胞株LoVo增殖活性的影響

圖3 microRNA-192對腸癌細(xì)胞株LoVo遷移能力的影響

3 討論

結(jié)直腸癌是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。近年來，隨著社會經(jīng)濟的飛速發(fā)展和人口老齡化日漸加劇，結(jié)直腸癌的發(fā)生率亦呈持續(xù)上升的態(tài)勢。據(jù)國家癌癥中心新近發(fā)布的癌癥發(fā)病與死亡統(tǒng)計數(shù)據(jù)估算，2015年我國新發(fā)結(jié)直腸癌病例數(shù)達38.76萬[4]。鑒于我國人口基數(shù)龐大，結(jié)直腸癌已逐漸成為重大的疾病負(fù)擔(dān)。盡管已有相關(guān)研究揭示了包括APC、KRAS、BRAF等基因突變在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，但僅有基因突變理論仍不足以闡釋結(jié)直腸癌多樣的生物學(xué)行為。表觀遺傳學(xué)異常尤其是DNA甲基化以及微小RNA、環(huán)狀RNA等非編碼RNA調(diào)控修飾在腫瘤惡性演進等方面的研究，近年來受到越來越多的關(guān)注。

microRNA是在生物體內(nèi)普遍存在的一類具有重要調(diào)控功能但不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA。大量研究已經(jīng)證實，microRNA可動態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、凋亡、遷移，參與生長發(fā)育、免疫應(yīng)答和腫瘤發(fā)生等多種病理生理過程[5-6]。microRNA-192編碼基因定位于人類染色體11q13.1位點。microRNA-192在消化道、腎臟和胸腺等正常組織中具有較高水平的表達。microRNA-192的表達失調(diào)與腎癌、肺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。Lokeshwar和Khella 等[7-8]研究發(fā)現(xiàn)，在腎細(xì)胞癌腫瘤組織中microRNA-192表達較正常組織顯著下調(diào)，過表達microRNA-192可抑制腎癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。在本研究比較了microRNA-192在結(jié)直腸癌、腺瘤和增生性息肉中的表達差異，發(fā)現(xiàn)microRNA-192在結(jié)直腸癌中的表達水平低于結(jié)直腸腺瘤和增生性息肉；在結(jié)直腸癌患者中，microRNA-192的表達水平與患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；而與患者的年齡、性別、腫瘤分級等參數(shù)無明顯的相關(guān)性；體外細(xì)胞實驗證實，microRNA-192抑制人腸癌細(xì)胞株LoVo的生長和遷移。

綜上所述，microRNA-192在結(jié)直腸癌中呈低表達狀態(tài)，且與腸癌細(xì)胞生長和遷移相關(guān)，有可能成為抗腫瘤治療的潛在靶點。microRNA-192具體作用機制仍然有待深入研究。