劉詩(shī)穎，何坤燕，李英華，朱 冰，諶素華 ，秦小明 ，鐘賽意 ，高加龍 ， 陳建平

（1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省亞熱帶果蔬加工科技創(chuàng)新中心，廣東湛江 524088；2. 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學(xué)，遼寧大連 116034；3. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市婦女兒童醫(yī)療中心中心實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510120；4. 廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東深圳 518108）

0 引言

在我國(guó)，癌癥問(wèn)題變得日益突出，每7～8 個(gè)人中就有1 人死于癌癥。當(dāng)前，治療癌癥的手段主要有手術(shù)、放療和化療3 種，然而由于存在藥物的耐藥性等問(wèn)題導(dǎo)致治療效果不理想，治愈率較低。因此，從自然界中篩選天然高效無(wú)毒的抗腫瘤藥物成為目前的研究熱點(diǎn)。

馬尾藻是一種產(chǎn)自中國(guó)廣東、海南等地的褐藻，其資源豐富[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全國(guó)共有130 種馬尾藻屬[2]，其中23 種在廣東沿海海域分布較多[3]。近年來(lái)，研究報(bào)道馬尾藻中富含具有多種生物活性的巖藻聚糖硫酸酯（Fucoidan）[4-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，馬尾藻是一種廣泛存在于褐藻及海洋無(wú)脊椎動(dòng)物當(dāng)中的含硫酸基的雜聚糖[8-9]。相關(guān)研究人員從Focus vesiculosus 中提取得到巖藻聚糖，發(fā)現(xiàn)其能夠抑制脂質(zhì)的積累[10]。課題組前期在馬尾藻多糖方面開(kāi)展了系列研究，研究表明馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂具有較好的抗氧化和降血脂效果[11-16]。然而，關(guān)于其抗腫瘤活性的研究報(bào)道較少。故選擇HepG2 細(xì)胞作為研究對(duì)象，采用MTT方法、流式細(xì)胞術(shù)和檢測(cè)ROS 含量考查馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯抑制HepG2 細(xì)胞增殖的能力，為馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯在抗腫瘤臨床藥物的應(yīng)用開(kāi)發(fā)中提供新的科學(xué)依據(jù)和技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂，實(shí)驗(yàn)室自制；人肝癌HepG2 細(xì)胞，美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)提供；正常人肝LO2 細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院（上海） 細(xì)胞庫(kù)提供；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco 公司提供；噻唑藍(lán)（MTT），美國(guó)Hyclone 公司提供；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司提供；活性氧檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供。其他試劑（分析純），國(guó)藥集團(tuán)提供。

1.2 儀器與設(shè)備

BP301S 型電子天平，德國(guó)Sartorius 公司產(chǎn)品；Versamax 酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices 公司產(chǎn)品；FACS Aria 流式細(xì)胞儀，美國(guó)Waters 公司產(chǎn)品。

1.3 馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂的提取

參考劉海韻等人[17]的方法提取馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂。取適量馬尾藻粉，按1∶30（g∶mL） 料液比加入蒸餾水，采用超聲波輔助水提法，經(jīng)離心、濃縮后，脫除褐藻膠、脂肪，真空冷凍干燥后獲得粗提物。加蒸餾水150 mL 溶解2 g 的粗提物，然后加Sevage 試劑，經(jīng)離心、透析后，真空冷凍干燥得到粗多糖。最后，用0.5 mol/L NaOH、0.5 mol/L HCl、0.5 mol/L NaCl 溶液活化DEAE-52 纖維素，將活化后的DEAE-52 纖維素裝入層析柱后，用1.0 mol/L NaCl 溶液對(duì)粗多糖溶液進(jìn)行洗脫，對(duì)應(yīng)洗脫出的組分即為純化后的馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和50 U/mL 鏈霉素的DMEM 完全培養(yǎng)液中。細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37 ℃，5% CO2），根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.5 MTT 檢測(cè)馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂抑制HepG2 和LO2 細(xì)胞生長(zhǎng)的效果

將細(xì)胞密度為 2×104、5×104個(gè)細(xì)胞 / 孔的HepG2 細(xì)胞和LO2 細(xì)胞接種于96 孔板，放入37 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入不同濃度馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂100 μL 處理細(xì)胞24 h 后，往96孔板中加入5 mg/mL MTT，每孔20 μL，置于培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2） 中孵育4 h，用移液器移去上清液后，每孔加入DMSO 150 μL，經(jīng)搖床振蕩10 min后，使用酶標(biāo)儀（SpectaMax 250） 測(cè)定各孔在570 nm 處的光密度（OD） 值。以空白對(duì)照組的OD 值為100%，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率的計(jì)算見(jiàn)公式（1）：

式中：Ai——不同處理組OD 值；

A0——空白對(duì)照組OD 值。

1.6 流式細(xì)胞儀分析馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對(duì)HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞，以2×104cell/mL 細(xì)胞密度鋪6 cm 培養(yǎng)皿，24 h 后分別按如下方式進(jìn)行加藥處理。其中，對(duì)照組不加藥；馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯組加入不同濃度的馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯[18]。將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間。用PBS 清洗2～3 次后用胰酶消化，然后收集細(xì)胞。參考細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用PBS 洗滌細(xì)胞一次（以轉(zhuǎn)速2 000 r/min 離心5 min） 收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，取1 mL 單細(xì)胞懸液，離心后，去除上清液，在細(xì)胞中加入70%冰乙醇500 μL 固定，置于-20 ℃冰箱中過(guò)夜。以轉(zhuǎn)速1 000 r/min 離心3 min 去掉冰已醇，加入500 μL PI/RNase A 染色工作液，室溫避光30 min 后上機(jī)待測(cè)。每個(gè)樣品至少分析10 000 個(gè)細(xì)胞。

1.7 ROS 含量檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞置于6 孔板上預(yù)培養(yǎng)24 h，分別按如下方式進(jìn)行加藥處理。其中，對(duì)照組不加藥；馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯組加入不同濃度的馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間后，參考活性氧檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。在37 ℃下，用10 μmol/L DCFH-DA 孵育細(xì)胞20 min，細(xì)胞經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌后，用PBS 重懸細(xì)胞，然后在熒光酶標(biāo)儀下檢測(cè)各組的熒光強(qiáng)度值變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度的馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對(duì)HepG2 細(xì)胞存活率的影響

采用MTT 方法評(píng)價(jià)馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對(duì)人肝癌HepG2 細(xì)胞存活率的影響，以正常肝LO2 細(xì)胞做對(duì)照。

不同質(zhì)量濃度的馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對(duì)HepG2 和LO2 細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同質(zhì)量濃度的馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對(duì)HepG2 和LO2 細(xì)胞存活率的影響

由圖1 可知，在馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂質(zhì)量濃度為0.5～4.0 mg/mL 內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的升高，馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對(duì)HepG2 細(xì)胞和LO2 的存活率呈逐漸降低趨勢(shì)，分別從88.78±0.05（0.5 mg/mL）、95.85±0.01（0.5 mg/mL） 降低到 43.94±0.07（4 mg/mL）、74.46±0.04（4 mg/mL），這表明馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對(duì)HepG2 細(xì)胞的抑制活性要強(qiáng)于正常肝LO2 細(xì)胞，表明具有較好的細(xì)胞選擇性。當(dāng)馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂的質(zhì)量濃度達(dá)到8 mg/mL 時(shí)，其對(duì)HepG2細(xì)胞和LO2 的存活率分別達(dá)到最大為11.61±0.002和25.11±0.001，研究表明馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂在較高質(zhì)量時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞也會(huì)造成巨大的損傷。故后續(xù)試驗(yàn)質(zhì)量濃度選擇在0.5～4.0 mg/mL 以內(nèi)。

2.2 不同質(zhì)量濃度的馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響

采用1，4 mg/mL 的馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂作用于HepG2 細(xì)胞24 h 后，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡情況。

馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂在不同質(zhì)量濃度下對(duì)HepG2 細(xì)胞周期的影響見(jiàn)圖2。

圖2 馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂在不同質(zhì)量濃度下對(duì)HepG2 細(xì)胞周期的影響

由圖2 可知，經(jīng)1，4 mg/mL 馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂處理后的HepG2 細(xì)胞凋亡率SubG1 峰從空白對(duì)照組的2.14%分別提高到16.6%和19.37%，且處于G0/G1 期的細(xì)胞從空白對(duì)照組的39.80%分別提高到53.73%和61.42%，上述試驗(yàn)結(jié)果表明，馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和G0/G1 期細(xì)胞周期阻滯來(lái)抑制細(xì)胞的增殖。

2.3 不同質(zhì)量濃度的馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS 含量的影響

1，2，4 mg/mL 的馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對(duì)ROS含量的影響。

不同質(zhì)量濃度的馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS 含量的影響見(jiàn)圖3。

由圖3 可知，在5 min 內(nèi)，相比空白處理組，1，2，4 mg/mL 馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS 含量明顯升高，分別從100%提高到364.16%，489.98%，560.87%，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，ROS 含量均呈下降趨勢(shì)，到60 min 之后這種下降趨勢(shì)變得較平緩，這可能是由于細(xì)胞在受到馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂刺激后，短時(shí)間細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)揮作用清除細(xì)胞內(nèi)的ROS，導(dǎo)致ROS 含量呈下降趨勢(shì)，由于ROS 過(guò)多，無(wú)法完全清除，最終導(dǎo)致ROS 含量下降趨勢(shì)變得較平緩。

圖3 不同質(zhì)量濃度的馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS 含量的影響

3 結(jié)論

運(yùn)用MTT 測(cè)定了馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對(duì)HepG2 肝癌細(xì)胞存活率的影響，并運(yùn)用流式細(xì)胞儀和檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 含量初步探究馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂抑制HepG2 增殖的機(jī)理。得到的結(jié)論如下：

（1） 經(jīng)馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂處理HepG2 細(xì)胞24 h 后，能顯著降低細(xì)胞的存活率，在測(cè)試質(zhì)量濃度內(nèi)，細(xì)胞存活率最低達(dá)到11.61%±0.002%，上述結(jié)果表明，馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對(duì)HepG2 肝癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制效果。

（2） 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞經(jīng)馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂處理24 h 后，能顯著提高凋亡細(xì)胞數(shù)目和G0/G1 期的細(xì)胞數(shù)目，進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 含量發(fā)現(xiàn)，馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂處理細(xì)胞后能夠提高細(xì)胞內(nèi)ROS 的含量，上述結(jié)果表明，馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡和G0/G1 期阻滯,從而抑制HepG2 細(xì)胞的增殖。