王云飛 孫洋洋 帕依曼·亥米提 潘曉晗 徐向偉 何承輝*

1.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004；2.天津藥物研究院新藥評價有限公司，天津 300301

中醫(yī)認(rèn)為氣血是構(gòu)成和維持人體生命活動的基本物質(zhì)，“氣為血帥，血為氣母”,兩者在物質(zhì)和功能上互生互助[1]。血瘀證是中醫(yī)臨床常見病理癥候[2]，與多種疾病相關(guān)，如冠心病、心絞痛，動脈粥樣硬化等[3-5]，其中醫(yī)治療原則為活血化瘀[6]。近年來中醫(yī)藥在早期預(yù)治心腦血管疾病[7-8]，發(fā)現(xiàn)有效的作用靶點[9-10]，開辟新的治療方法等方面有很好的療效和廣闊的應(yīng)用前景[11-12]，成為該領(lǐng)域的研究熱點。

景紅顆粒是由紅景天、赤芍、黃芪等藥材組成的復(fù)方制劑，藥材紅景天中的苷類成分紅景天苷和赤芍中的單萜及其苷類成分芍藥苷，黃芪中的皂苷類有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷，這些有效成分都具有益氣行血、活血化瘀、通絡(luò)開竅等功效[13]。

景紅顆粒臨床應(yīng)用多年，療效確切，具有活血通脈、養(yǎng)心益氣、化瘀止痛的功效，用于氣虛血瘀所致的冠心病、心絞痛等心血管疾病[13]。本研究采用急性大鼠血瘀模型，評價景紅顆粒對大鼠血小板聚集功能和血液流變學(xué)的影響，闡述傳統(tǒng)中醫(yī)病機和現(xiàn)代疾病發(fā)生發(fā)展機制以及兩者的聯(lián)系，明確藥理作用機制，為景紅顆粒臨床用藥的有效性及新藥研發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 景紅顆粒由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所提供，新疆銀朵蘭維藥股份有限公司生產(chǎn)，批號180920。為黃棕色至棕色顆粒劑，鋁塑袋包裝，每袋6 g。臨用時以0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配制成所需濃度藥液，供動物給藥用。參芍膠囊保定天浩制藥有限公司生產(chǎn)，批號181003。每粒膠囊250 mg。臨用時,倒出膠囊內(nèi)容物，以0.5%CMC-Na配制成所需濃度藥液，供動物給藥用。腺苷二磷酸鈉(Adenosine Diphosphate,ADP)：SIGMA公司產(chǎn)品，批號01905?；ㄉ南┧徕c(Arachidonic,AA)：SIGMA公司產(chǎn)品，批號SLBT0162。膠原(Collagen,CG)：CHRONO-LOG公司產(chǎn)品，批號3479。BCA蛋白濃度測定試劑盒，索萊寶科技有限公司(Solarbio)產(chǎn)品，批號20190904。GF254薄層色譜硅膠：青島海洋化工廠；有機溶劑均為國產(chǎn)分析純。1.2 動物 SD大鼠，SPF級，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2019-0010。

Wistar大鼠，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2016-0006。

1.3 儀器與設(shè)備 540型血小板聚集儀，美國CHRONO-LOG公司產(chǎn)品。LBY-6COMPACT全自動血液流變儀，北京普利生儀器有限公司產(chǎn)品。

1.4 實驗方法

1.4.1 血瘀模型大鼠的制作 大鼠雌雄各半，參照文獻(xiàn)方法[10]除正常對照組外，于實驗前一天皮下注射0.1%鹽酸腎上腺素0.8 mL/kg，共2次，間隔6 h，期間(約3 h)將大鼠放入冰水中游泳 5 min，禁食不禁水過夜，造成血瘀模型。

1.4.2 血瘀大鼠血小板聚集檢測 雄性SD大鼠，按體重隨機分為6組，每組10只。每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d，給藥體積均為10 mL/kg。正常對照組和模型對照組給予0.5%CMC-Na、受試物藥組給予景紅顆粒，劑量分別為0.9、1.8、3.6 g/kg；陽性藥組給予參芍顆粒200 mg/kg。給藥第6天造模，次日給藥后60 min水合氯醛麻醉(360 mg/kg,ip)，腹主動脈取血，3.2%枸櫞酸鈉抗凝，全血與抗凝劑體積之比9∶1，800 rpm離心10 min制備富血小板血漿(PRP)，3000 rpm離心10 min制備貧血小板血漿(PPP)。以PPP調(diào)PRP，使其血小板計數(shù)保持在(3.5～4.0)×108個/mL。比濁法測定血小板聚集率。以PPP調(diào)100%，PRP調(diào)零，在連續(xù)攪拌下加入誘導(dǎo)劑二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸鈉(AA)、膠原(CG)，引起血小板聚集。觀察不同藥物對血小板聚集功能的影響，并與溶劑對照組比較，計算血小板聚集抑制率。

1.4.3 血液流變學(xué)參數(shù)測定 雄性Wistar大鼠，隨機分為6組，每組10只。每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d，給藥體積均為10 mL/kg。正常對照組和模型對照組均給予0.5%CMC-Na，受試藥組給予景紅，劑量分別為0.9、1.8、3.6 g/kg，相當(dāng)于人臨床擬用量的0.5、1、2倍；陽性藥組給予參芍，劑量為200 mg/kg，相當(dāng)于臨床用量。給藥第6天造模，次日給藥后60 min水合氯醛麻醉，腹主動脈取血7 mL，5 mL置肝素化試管抗凝，進(jìn)行全血粘度測定，3000 rpm、25 ℃離心10 min后取血漿測定血漿粘度，2 mL置紅細(xì)胞壓積管枸櫞酸鈉抗凝，并同時以紅細(xì)胞壓積管測定紅細(xì)胞壓積。

1.4.4 對血栓纖維蛋白量的影響 雄性SD大鼠，按體重隨機分為5組，每組10只。給藥方法同上。末次給藥后1 h，35%水合氯醛麻醉(350 mg/kg,ip)，大鼠仰臥位固定，分離頸總動脈，置于BT87-3型實驗性體內(nèi)血栓形成測定儀的刺激電極和溫度探頭鉤上，溫度探頭在遠(yuǎn)心端，刺激電極靠近心端。記錄從刺激開始到動脈溫度驟降所需的時間(s)，作為動脈血栓形成時間。實驗結(jié)束取出頸動脈內(nèi)的血栓，將其置于1 mL 0.5N NaOH溶液中，待血栓溶解后測定血栓纖維蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 景紅顆粒對血小板聚集功能的影響 造成“血瘀”模型后，ADP、AA、CG均可誘導(dǎo)模型大鼠PRP產(chǎn)生明顯的血小板聚集現(xiàn)象，連續(xù)7 d給予景紅0.9、1.8、3.6 g/kg能對血小板聚集產(chǎn)生明顯的抑制作用，1.8 g/kg景紅與參芍比較，無明顯差異。結(jié)果見表1。

表1 景紅對大鼠血小板聚集率的影響

2.2 景紅顆粒對血瘀大鼠血液流變學(xué)參數(shù)的影響

2.2.1 對全血粘度的影響 造成“血瘀”模型后，可見動物全血粘度增加，與模型對照組相比有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01～0.001)。高劑量景紅可明顯降低低切變率下全血粘度，對高切變率下全血粘度未見明顯影響。說明藥物可抑制"血瘀"模型所造成的全血粘度增加。陽性藥物參芍不影響各切變率下全血粘度。結(jié)果見表2。

表2 景紅對大鼠全血粘度(mPa·s)的影響

2.2.2 對血漿粘度和血細(xì)胞壓積的影響 造成“血瘀”模型后，可見動物血漿粘度增加，與溶劑對照組相比有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。給予景紅0.9、1.8、3.6 g/kg后血漿粘度與模型對照組無明顯差異。對紅細(xì)胞壓積亦無明顯影響。陽性藥物參芍對血漿粘度和紅細(xì)胞壓積無明顯影響。結(jié)果見表3。

表3 景紅對大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)的影響

2.3 對大鼠血栓形成的影響

2.3.1 對動脈血栓形成時間的影響 結(jié)果表明，大鼠灌服景紅能劑量依賴性延長電刺激引起的動脈血栓形成時間，與溶劑對照組比較0.9、1.8、3.6 g/kg分別延長了9.8%(P>0.05)、23.4%(P<0.05)、36.6%(P<0.01)。參芍明顯延長血栓形成時間，延長了17.7%(P<0.05)。1.8 g/kg景紅與參芍比較，無明顯差異。結(jié)果見表4、圖1。

表4 景紅對大鼠實驗性血栓形成時間的影響

2.3.2 對血栓纖維蛋白量的影響 結(jié)果表明，大鼠灌服景紅0.9、1.8、3.6 g/kg能劑量依賴性減少電刺激引起的動脈血栓纖維蛋白量，與溶劑對照組比較分別減少了20.6%(P>0.05)、32.4%(P>0.05)、52.6%(P<0.01)。參芍不影響血栓纖維蛋白。1.8 g/kg景紅與參芍比較，無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果見表5、圖1。

表5 景紅對大鼠動脈血栓纖維蛋白量的影響

3 討論

正常的血液流變性能保持組織灌注和代謝功能。凝血和纖溶系統(tǒng)是調(diào)節(jié)人體血液凝固和纖維蛋白溶解的調(diào)控系統(tǒng)[14]，是維持血液的正常功能、血管通暢的關(guān)鍵調(diào)控因素，血小板在血栓形成過程中發(fā)揮重要作用[15]。血液功能的異常表現(xiàn)為凝血及纖溶活性異常，血液流變性異常，血流動力學(xué)異常等[16-17]。全血粘度、血漿粘度、紅細(xì)胞壓積等指標(biāo)的改變是氣滯血瘀癥的物質(zhì)基礎(chǔ)[18]。

中醫(yī)藥在治療氣虛血瘀型冠心病心絞痛中能發(fā)揮獨特且重要的作用[19-21]，治療上多以活血化瘀為主要手法，輔以益氣、溫陽、化濁等治療原則[22-24]。冠心病心絞痛在中醫(yī)理論中屬“胸痹”的范疇，胸痹的病機大致分四種，腎氣虛衰心脈痹阻、飲食不節(jié)痰郁化火、情志失調(diào)肝郁氣滯以及素體陽虛外感寒邪而導(dǎo)致心血瘀阻而發(fā)病，也就是心脈發(fā)生了血瘀證。血瘀證往往伴隨血液和血管異常而導(dǎo)致血液循環(huán)障礙[25]。本研究采用的動物模型是一種經(jīng)典的血瘀模型，屬于中藥藥理研究常用經(jīng)典方法，即給小鼠注射腎上腺素，造成其活動增加，類似于中醫(yī)所講陽氣過度消耗而致陽虛，再進(jìn)行低溫游泳模擬外感陰寒之邪并在強迫運動中進(jìn)一步消耗其陽氣，造成氣(陽)虛血瘀模型[26]。病機類似于氣虛血瘀型，素體陽虛胸陽不振者遇陰寒之邪趁虛而入，則寒凝氣滯，血行不暢而致心血瘀阻。實驗結(jié)果表明，模型大鼠較正常動物血粘度增高，較正常血小板對誘導(dǎo)劑(ADP、AA)敏感度上升，血液呈高凝、高黏的狀態(tài)，說明造成了“血瘀”的模型。

本實驗?zāi)康氖翘接懢凹t顆粒治療冠心病心絞痛的機制，并針對其活血通脈、養(yǎng)心益氣的治則選用了氣虛血瘀的模型。景紅顆粒也遵循這些治則進(jìn)行了組方，結(jié)果表明該藥可改善模型大鼠血液流變學(xué)，抑制血小板聚集，還可明顯延長正常動物血栓形成時間，減少血栓纖維蛋白量，說明景紅顆粒有明顯的抗血栓作用，也體現(xiàn)了中醫(yī)所講的活血化瘀作用。綜上所述，景紅顆粒的藥理作用及其機制是：通過抗血小板聚集、抗栓作用和改善血液流變學(xué)的作用，發(fā)揮其活血化瘀的功效，可用于防治冠心病心絞痛，還可能通過該作用防治其他血栓性疾病。研究結(jié)論為景紅顆粒在新藥研發(fā)和臨床應(yīng)用階段提供理論基礎(chǔ)。