于 紅，馬美娜，周真真，郭慶奪，于紅美

(河北省滄州市中心醫(yī)院麻醉科，河北 滄州 061000)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要由神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞核小膠質(zhì)細(xì)胞等構(gòu)成，而星形膠質(zhì)細(xì)胞在維持神經(jīng)元代謝及谷氨酸平衡中扮演著重要角色，一旦缺血再灌注損傷發(fā)生后，由于能量代謝及氧供需失衡，可誘發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的死亡[1-3]。蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)在調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激中發(fā)揮著重要作用，抑制PKA過度激活能夠減輕氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞凋亡和焦亡[4]。既往研究表明，PTEN誘導(dǎo)性激酶蛋白1(PTEN induced putative kinase 1，PINK1) E3泛素連接酶(E3 ubiquitin ligases，Parkin)途徑是特異性調(diào)控線粒體自噬的信號(hào)通路[5-6]，抑制PKA表達(dá)上調(diào)可減少PINK1募集細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Parkin，減輕線粒體過度損傷和自噬[7]。本研究擬通過建立體外大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪-復(fù)糖復(fù)氧模型，以揭示PKA-PINK1/Parkin信號(hào)通路在神經(jīng)系統(tǒng)缺血再灌注損傷中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 24 h內(nèi)的SD新生大鼠，共168只，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)提供(SYXK(京)2012-0036)。分離腦組織后，行原代大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，并將所分離培養(yǎng)的原代大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞分為4組，每組42只，分別為對(duì)照組(C組)、氧糖剝奪組(oxygen-glucose deprivation，OGD/R組)，H89+氧糖剝奪(H89+OGD/R, HO組)，H89對(duì)照組(H組)。其中，凋亡率、焦亡率、生存率、鈣離子濃度測(cè)定、ROS測(cè)定、PKA測(cè)定、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Parkin和Pink1表達(dá)測(cè)定)各需要6只大鼠。

1.2原代大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 出生24 h內(nèi)的SD大鼠，在無菌平衡鹽溶液(D-Hank液)中將大鼠的腦皮質(zhì)充分剝離，并將皮質(zhì)剪碎后放置在15 mL的無菌離心管內(nèi)，取與細(xì)胞容積等量的胰酶(0.125%，HyClone，美國(guó))加入離心管內(nèi)，使其終濃度為0.062 5%，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化10 min，并在消化至5 min時(shí)輕搖1次。消化結(jié)束后，向離心管內(nèi)加入等容量接種液(DMEM-F12，20%FBS，10%HS)(Hyelone公司，美國(guó))，以終止消化反應(yīng)。1 000×g離心5 min后棄去上清液，再次向離心管內(nèi)加入2～3 mL接種液，吸管吹打2～3下后200目濾網(wǎng)過濾，細(xì)胞懸液收集至新的無菌離心管內(nèi)，倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)下用計(jì)算原代細(xì)胞密度，并使用接種液將細(xì)胞密度調(diào)至1×105/mL。37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，2～3 d半量換液1次，待培養(yǎng)至第7天時(shí)，F(xiàn)BS濃度降低至10%。培養(yǎng)至第21天的原代大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞通過星形膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)蛋白GFAP免疫熒光染色，進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定，其陽(yáng)性表達(dá)率超過95%可繼續(xù)用于實(shí)驗(yàn)。

1.3氧糖剝奪模型的建立 實(shí)施氧糖剝奪處理前1 h，向HO和H組培養(yǎng)基內(nèi)加入PKA特異性抑制劑H89(10 μmol/L，批號(hào)：L1643，Merck公司，德國(guó))。OGD/R和HO組細(xì)胞氧糖剝奪的實(shí)施方法為PBS洗滌原代大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞3次后，更換為無糖培養(yǎng)基BBS(HyClone，美國(guó))，先向無糖培養(yǎng)基中持續(xù)以2 L/min的速度通入100% N230 min，再將培養(yǎng)基放入低氧培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))內(nèi)。向低氧培養(yǎng)箱中持續(xù)輸入95% N2和5% CO2，處理6 h后，將培養(yǎng)基的培養(yǎng)液更換為含有10%FBS的接種液的正常培養(yǎng)基。OGD/R組和HO組培養(yǎng)基在正常的培養(yǎng)環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，C組和H組使用PBS洗滌細(xì)胞3次，置于含有5% CO2的正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4凋亡率、焦亡率和存活率的測(cè)定 每組各取6孔，分別采用Annexin V-FITC/PI和cleaved caspase-1/PI雙染色法測(cè)定皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和焦亡程度。每孔加入0.125%胰酶2 mL消化并中和后，4 ℃下150×g離心10 min，棄上清重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.5×105個(gè)/mL，將收集的細(xì)胞重懸于 200 μL 緩沖液中；加入 5 μL Annexin V-FITC或cleaved caspase-1試劑(碧云天生物制劑有限公司，中國(guó))，避光室溫孵育15～20 min; 加入10 μL PI(50 mg/L)，補(bǔ)加緩沖液 200 μL，采用FACS420型流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson公司，美國(guó))檢測(cè)，Annexin V-FITC(+)/PI(-)占總細(xì)胞的百分比即為星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率，cleaved caspase-1 (+)/PI(+)占總細(xì)胞的百分比即為星形膠質(zhì)細(xì)胞焦亡率。四甲基偶氮唑法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法用于測(cè)定星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活率。向每孔培養(yǎng)基內(nèi)加入MTT溶液(濃度為5 g/L，碧云天生物制劑有限公司，中國(guó))20 μL，5% CO2的正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)繼續(xù)孵育4 h。將培養(yǎng)基棄去，向每孔細(xì)胞加入150 μL DMSO溶液，充分震蕩10 min后，在490 nm波長(zhǎng)處使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度(A值)，以同批次C組作為對(duì)比，計(jì)算星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率[8]。

1.5游離鈣離子濃度的測(cè)定 每組取6孔，棄去上清培養(yǎng)液后，使用無鈣PBS(pH=7.0)洗滌2次，向每孔細(xì)胞內(nèi)加入10 μmol/L Fluo-3/AM(Biotium公司，美國(guó)) 200 μL，5% CO2的37 ℃正常培養(yǎng)箱中孵育30 min后取出，使用DMEM培養(yǎng)基漂洗3遍。FV300激光共聚焦顯微鏡(Olympus公司，日本)下觀察熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)520 nm，采集圖像，采用LSM510 25 SP2軟件(Zeiss公司，德國(guó))進(jìn)行分析，以熒光指數(shù)反應(yīng)[Ca2+]i。

1.6ROS水平的測(cè)定 每組取6孔，二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′, 7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)法測(cè)定ROS含量。同上述凋亡率和焦亡率測(cè)定方法，向收集的細(xì)胞內(nèi)加入終濃度為10 μmol/L DCFH-DA(Sigma公司，美國(guó))溶液，充分振蕩混勻后，37 ℃的5% CO2正常細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20 min，每隔5 min吹打數(shù)次，孵育結(jié)束后在4 ℃下150×g離心5 min，D-Hanks平衡液重懸細(xì)胞，F(xiàn)ACS420型流式細(xì)胞儀在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)、525 nm發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定熒光強(qiáng)度值，反映ROS含量。

1.7PKA活性檢測(cè) 每組取6孔，采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)PKA活性。大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)0.125%胰酶消化10 min后，終止反應(yīng)，細(xì)胞質(zhì)提取試劑盒(Thermo公司，美國(guó))提取星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)蛋白。按照每1 mL細(xì)胞懸液加入1 mL CER Ⅰ(含有其中1 mmol/L蛋白酶抑制劑)試劑，在研磨器中研磨10次，振蕩15 s，靜置1 min后加入CER Ⅱ試劑，振蕩5 s，靜置1 min后，4 ℃下16 000×g離心5 min，取上清液行二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測(cè)定樣品濃度。PKA活性檢測(cè)依據(jù)試劑盒說明書操作(Genmed公司，美國(guó))，在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品，分別加入50 μL Genmed底物液、已準(zhǔn)備好的標(biāo)準(zhǔn)液和待測(cè)樣品、50 μL Genmed反應(yīng)液，室溫下孵育20 min，加入50 μL Genmed酶解液室溫下孵育30 min，加入50 μL Genmed終止液，以空白對(duì)照孔為零，450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品PKA活性。

1.8蛋白免疫印記檢測(cè) 每組取6孔，使用細(xì)胞裂解液(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)(索萊寶有限公司，中國(guó))將細(xì)胞裂解，超聲擊碎細(xì)胞，BCA法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)總蛋白濃度。在100 ℃下孵育5 min使蛋白變性，加入loading buffer后，每孔30 μg蛋白樣品，8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)中電壓恒定進(jìn)行電泳，電流恒定濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，TBST洗膜，加入兔抗鼠PINK1(1∶500，批號(hào)：ab216144，abcam公司，英國(guó))和Parkin(1∶500，ab233434，Abcam，英國(guó))多克隆抗體37 ℃ 1 h孵育，TBST洗膜3次，每次10 min，山羊抗兔二抗(1∶1 000，武漢博士的生物制劑有限公司，中國(guó))25 ℃ 1 h孵育，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL發(fā)光，以GADPH作為內(nèi)參照[9]，以目的條帶和內(nèi)參條帶灰度值的比值反映表達(dá)水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1凋亡率和焦亡率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與C組比較，OGD/R組和HO組皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡率升高，焦亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與OGD/R組比較，HO組皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡率下降，焦亡率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組與H組凋亡率和焦亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與C組比較，OGD/R組和HO組皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與OGD/R組比較，HO組皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組與H組存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與C組比較，OGD/R組和HO組皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與OGD/R組比較，HO組皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組與H組細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1和圖1。

2.4ROS含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與C組比較，OGD/R組和HO組皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的ROS含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與OGD/R組比較，HO組皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的ROS含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組與H組ROS含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.5PKA活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與C組比較，OGD/R組和HO組皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的PKA活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與OGD/R組比較，HO組皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的PKA活性下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組與H組PKA活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.6Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與C組比較，OGD/R組和HO組皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的PINK1和Parkin表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與OGD/R組比較，HO組皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的PINK1和Parkin表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組與H組的PINK1和Parkin表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1和圖2。

表1 4組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率、焦亡率、存活率、Fluo-3/AM熒光指數(shù)、ROS、PKA活性、PINK1和Parkin表達(dá)的比較Table 1 Comparison of apoptosis,pyroptosis,viability,Fluo-3/AM fluorescence index,ROS,PKA activity,and expressions of PINK1 and Parkin in cultured rat astrocyte in the four groups

圖1 4組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞鈣離子熒光染色

圖2 4組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞PINK1和Parkin表達(dá)

3 討 論

原代培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞是常用的離體研究神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能的良好模型[10]。氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧是模擬在體缺血再灌注損傷模型中重要體外模型，與單純的缺氧復(fù)氧模型比較，更接近于在體的病理生理狀態(tài)[11]。Annexin V通過與細(xì)胞膜表面的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，提示細(xì)胞處于早期凋亡階段；PI的陰性與陽(yáng)性可表示細(xì)胞處于凋亡早期或晚期[12]。作為一種已發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡形式，其特征為caspase-1激活后裂解為cleaved caspase-1，形成焦亡小體，啟動(dòng)焦亡程序，cleaved caspase-1/PI聯(lián)合染色常被用于檢測(cè)細(xì)胞的焦亡程度[13]。本研究表明，大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞在氧糖剝奪6 h并復(fù)糖復(fù)氧24 h后，Annexin V-FITC(+)/PI(-)和cleaved caspase-1(+)/PI(+)細(xì)胞明顯增加，存活率下降，表明該體外缺血再灌注損傷模型可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和焦亡增加，存活率下降。

當(dāng)機(jī)體受到缺血后，線粒體能量缺失；而再灌注發(fā)生后可導(dǎo)致線粒體過度氧化應(yīng)激，ROS過度生成，鈣離子超載[14]。既往研究表明，線粒體受損后可導(dǎo)致PINK1快速募集Parkin，形成PINK1/Parkin復(fù)合體，引發(fā)線粒體外膜包裹，最終誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放至細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致凋亡[15]。ROS的過度生成及鈣離子超載后，可激活caspase-1裂解，形成焦亡小體，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡[16]。本研究結(jié)果顯示，大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞在氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧后，ROS含量增加，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，同時(shí)PINK1和Parkin表達(dá)水平增加，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡和焦亡可能與缺血再灌注損傷后，線粒體氧化應(yīng)激過度導(dǎo)致PINK1/Parkin通路的激活后過度表達(dá)相關(guān)。

H89透過細(xì)胞膜后與PKA結(jié)合，影響其下游的底物和亞基結(jié)合，從而抑制PKA活性[17]；缺血再灌注損傷可導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)PKA活性增加，抑制PKA過度激活可減少神經(jīng)元凋亡，其機(jī)制可能與PKA減少PINK1/Parkin信號(hào)通路激活相關(guān)[18]。既往研究表明，降低PKA活化，可減少PINK1/Parkin信號(hào)通路的泛素化，減輕帕金森病的惡化進(jìn)程[19]；而增加PKA磷酸化激活，可上調(diào)PINK1/Parkin誘發(fā)的線粒體自噬，誘發(fā)細(xì)胞進(jìn)入凋亡周期[20]。結(jié)合參考文獻(xiàn)[21]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究采用10 μmol/L H89作用于氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧后的大鼠皮質(zhì)星形細(xì)胞，顯示H89能夠顯著抑制PKA活性，同時(shí)降低氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡、焦亡和PINK1、Parkin的表達(dá)，增加細(xì)胞存活率，同時(shí)減少ROS生成，抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載。以上結(jié)果表明抑制PKA過度活化可減輕氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體損傷，抑制細(xì)胞凋亡和焦亡。

綜上所述，抑制PKA過度活化能夠減輕氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖后大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和焦亡，其機(jī)制與抑制PINK1/Parkin信號(hào)通路激活相關(guān)。