陳思憶，李莉，胡一新，麥小斌，黃家宇*

(1.貴州醫(yī)科大學 藥學院，貴州 貴陽 550004；2.貴陽市第二人民醫(yī)院 骨科，貴州 貴陽 550004；3.廣東藥科大學 生命科學與生物制藥學院基礎醫(yī)學研究所，廣東 廣州 510006)

下肢深靜脈血栓(lower extremity deep venous thrombosis，DVT)是一種靜脈內(nèi)血凝塊阻塞而引起的周圍血管病，常繼發(fā)于創(chuàng)傷、分娩、腫瘤及手術等，是骨科手術患者常見的并發(fā)癥[1-2]，且易導致肺栓塞，嚴重者甚至危及生命[3-4]。肝素(heparin，Hep)是一種經(jīng)典的抗凝血藥物[5]，臨床上常用于預防血栓的形成和治療急性靜脈血栓[6-7]，但是目前肝素在預防DVT時存在一些明顯的缺陷，如注射后出血、藥效作用時間短、給藥頻繁及病人順應性差等[8]，造成肝素的使用受到了限制，因此肝素緩釋材料研究逐漸受到關注。目前肝素緩釋材料主要有肝素緩釋微球和載肝素組織工程材料，Amit等[9]利用肝素乳化工藝制得肝素緩釋微囊，使得改良后肝素緩釋微球的藥物半衰期遠高于一般肝素；國內(nèi)研究結果表明，制備肝素緩釋組織工程材料可達到良好的肝素緩釋效果[10-11]。脂質(zhì)體(liposomes)是指兩親性磷脂和膽固醇分子形成的相互間隔、定向排列組成的具有雙分子層結構的封閉囊泡[12]，將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)能讓藥物具有緩慢釋放、降低毒性及改變給藥途徑等優(yōu)點[13]。溫敏水凝膠(thermosensitive hydrogels)是一類對溫度變化敏感的高分子聚合物材料，在體外相較體溫較低時呈液態(tài)，而在體內(nèi)則呈固態(tài)，可通過局部注射到達人體病患部位，發(fā)揮靶向治療作用，還可維持體內(nèi)的血藥濃度，降低不良反應，減少給藥次數(shù)和血藥濃度的波動，發(fā)揮緩慢釋放的作用[14-15]。因此，本研究用大豆卵磷脂和膽固醇作為脂質(zhì)體的膜材，用人體可降解吸收的天然高分子材料殼聚糖作為凝膠載體材料，制備一種安全無毒的肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠皮下緩釋注射劑，期望能為肝素治療DVT提供一種改良的給藥途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥材來源 肝素鈉(效價195.8 IU=1 mg，批號NHS180403，河北常山生化藥業(yè)股份有限公司)，亞甲基藍(批號61734，大連美倫生物技術有限公司)。

1.1.2主要儀器 AUY120型電子分析天平、UV2700型紫外可見分光光度計(日本島津公司)，DK-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)，HNY-100B型智能恒溫培養(yǎng)振蕩器(天津歐諾儀器股份有限公司)，B-490型旋轉蒸發(fā)儀(瑞士步琦公司)，TGL-16G型離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.1.3主要試劑 脫乙酰度95%的殼聚糖(chitosan，CS；批號9012764)和膽固醇(批號57885，大連美倫生物技術有限公司)，β-甘油磷酸鈉(β-sodium glycerophosphate，β-GP，批號1120H031)和大豆卵磷脂(批號420H021，北京索萊寶生物科技有限公司)，二氯甲烷(分析純，批號20160630，天津市科密歐化學試劑有限公司)，實驗用水均為純化水。

1.2 方法

1.2.1肝素鈉溶液和亞甲基藍溶液的配制 精密稱取肝素鈉0.025 5 g和亞甲基藍0.048 0 g，分別置于100 mL容量瓶中，純水定容至刻度配制成50 000 IU/L和0.48 g/L儲備液。取儲備液加純水分別稀釋得1 000 IU/L肝素鈉溶液和0.24 g/L亞甲基藍溶液。

1.2.2專屬性 取一定濃度的肝素鈉、空白制劑分別與亞甲基藍溶液進行反應，于紫外可見分光光度計400～800 nm波長進行紫外掃描，確定其最大吸收波長。

1.2.3線性關系與定量限、檢測限 取“1.2.1”項下肝素鈉溶液，純水依次稀釋濃度為250、200、150、100及50 IU/L，加亞甲基藍溶液配成0.024 g/L濃度，得供試品；于664 nm處測定試劑空白吸光度值(A0)，不同濃度肝素鈉溶液吸光度值(An)，△A=A0-An，以濃度(C)作為x軸，吸光度(△A)作為y軸，作線性回歸，計算其定量限與檢測限。

1.2.4穩(wěn)定性、精密度與重復性 取“1.2.3”項下高、中及低(250、150及50 IU/L)濃度的肝素鈉溶液，于664 nm處測定An值，12 h內(nèi)重復6次，考察供試品的穩(wěn)定性與精密度。各濃度溶液連續(xù)測定6次，考察重復性。

1.2.5加樣回收率 精密稱取空白制劑，配制肝素濃度分別為完全溶出時的80%、100%和120%的肝素溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液，于664 nm處測定An值，計算回收率。

1.2.6肝素脂質(zhì)體的制備 參考文獻[16-20]和預實驗結果，確定以卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比(A因素)、卵磷脂與肝素的質(zhì)量比(B因素)及水化時間(C因素)為本次正交試驗的3因素，各設立3個水平，A因素為4 ∶1、6 ∶1及8 ∶1，B因素為10 ∶1、15 ∶1及20 ∶1，C因素為1、1.5及2 h，并以包封率為考察指標，進行L9(33)正交試驗；初步條件摸索也考察了溫度、轉速及有機溶劑對包封率的影響。采用薄膜分散-超聲法制備脂質(zhì)體，根據(jù)處方按一定比例精密稱取卵磷脂和膽固醇置于100 mL茄形瓶中，二氯甲烷10 mL溶解，水浴溫度25 ℃減壓旋轉蒸發(fā)除去有機溶劑，至卵磷脂與膽固醇在茄形瓶內(nèi)壁形成一層均勻的淡黃色薄膜，加PBS緩沖液(pH 7.4)溶解的肝素鈉溶液，50 ℃水浴震蕩至磷脂膜水化完全，超聲處理10 min，即得淡黃色肝素脂質(zhì)體。

1.2.7溫敏水凝膠的制備 精密稱取一定量CS和β-GP，分別溶于0.1 mol/L冰醋酸溶液和純水中，配制成1.5%、1.8%、2.0%及2.2%的CS溶液和45%、50%、56%及60%的β-GP溶液。冰水浴條件下，邊攪拌邊向CS溶液中逐滴加β-GP溶液，得到一系列CS和β-GP質(zhì)量比不同的澄清溶液，置于(37±0.5)℃恒溫水浴鍋中，采用目視結合試管倒轉方法觀察凝膠狀態(tài)并記錄膠凝時間，同時根據(jù)CS與β-GP最佳質(zhì)量比配制含肝素溫敏水凝膠，并考察不同緩釋材料對溫敏水凝膠釋放性能的影響。

1.2.8肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠的制備 根據(jù)“1.2.6”項下正交試驗確定肝素脂質(zhì)體最佳制備工藝制備一定量的脂質(zhì)體，常溫備用；根據(jù)“1.2.7”項下篩選出制備溫敏水凝膠的CS與β-GP最佳質(zhì)量比，取一定量的肝素脂質(zhì)體與2%CS溶液置于冰浴中，攪拌混合均勻，緩慢滴加56%β-GP溶液，用磁力攪拌器攪拌均勻，可制得肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠[21-22]。

1.2.9體外釋放度測定 采用動態(tài)透析袋法，對肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠進行體外釋放度測定。將制劑放入預先處理的透析袋中，置于盛有25 mL PBS溶液(pH 7.4)的燒杯，溫度為(37±0.5)℃，振蕩轉速100 r/min，按時間點0.5、1、2、4、6、8、16、24、36、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288、312、336及360 h依次取樣，補充等溫等體積的同批次PBS溶液；以空白脂質(zhì)體CS/β-GP溫敏水凝膠為對照，于664 nm處用紫外-可見分光光度法測定△A，根據(jù)標準曲線，計算不同時間點釋放介質(zhì)中肝素的含量，根據(jù)累積釋放度公式F=Mt/M∞，Mt/M∞為t時間肝素累積釋放百分率(%)，來求出各時間點的累積釋放度，繪制體外累積釋藥曲線。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 方法學考察

2.1.1專屬性 結果顯示，亞甲基藍與肝素于664和575 nm處均有吸收，且664 nm處吸收最大，同時在此條件下空白制劑均無干擾。

2.1.3穩(wěn)定性、精密度及重復性 室溫下，絡合反應于0.5 h內(nèi)反應完全，且此后的12 h穩(wěn)定，肝素高、中、低濃度的穩(wěn)定性RSD分別為1.2%、1.77%及1.09%，表明該方法穩(wěn)定性較好；日內(nèi)精密度RSD分別為1.56%、2.17%及1.16%，日間精密度RSD分別為2.08%、2.55%及1.48%，表示該方法精密度較良好；重復性考察的RSD分別為1.03%、0.45%及0.22%，表示該方法重復性好。

2.1.4加樣回收率 肝素完全溶出80%、100%及120%的回收率分別為99.67%、100.79%及100.24%，RSD為0.56%，表明該方法回收率較好。

2.2 肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠的制備及體外釋放度的測定

2.2.1脂質(zhì)體的正交實驗 正交實驗結果表明(表1和表2)，最優(yōu)處方為A2B1C2，即卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為6 ∶1，卵磷脂與藥物的質(zhì)量比為10 ∶1，水化時間為1.5 h；方差分析結果顯示(表2)，B因素差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且各因素對指標影響大小次序為B>C>A；處方工藝驗證結果表明(表3)，3批次脂質(zhì)體RSD為2.07%，各批次間差異小，工藝重現(xiàn)性良好，制備工藝穩(wěn)定、可靠。

表1 L9(33)正交試驗結果Tab.1 Results of the L9(33)orthogonal design

表2 正交試驗方差分析結果Tab.2 Results of analysis of variance in the orthogonal test

表3 各批脂質(zhì)體處方工藝驗證結果Tab.3 Results of three batches of liposomes of prescription process verification

2.2.2溫敏水凝膠的篩選 在一定條件下，CS與β-GP的質(zhì)量比減小，膠凝化過程縮短。制備好的溫敏水凝膠在低溫條件下，呈乳白、均勻、可流動的液體狀(L)；當溫度接近正常生理體溫，發(fā)生膠凝化轉變，成膠后為乳白色不可流動的半固體凝膠(S)；凝膠化前可用1 mL醫(yī)用注射針頭順利吸取注射，成膠后不可注射。見表4。

表4 CS與β-GP質(zhì)量比對溫敏水凝膠凝膠化時間的影響Tab.4 Effect of mass ratio of CS and β-GP on gelation time of CS/β-GP thermosensitive hydrogel

2.2.3肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠體外釋藥動力學 經(jīng)脂質(zhì)體與CS/β-GP雙重包載的Hep可注射脂質(zhì)體溫敏水凝膠對Hep釋放具有緩釋作用，Hep在pH 7.4的釋藥介質(zhì)中前0.5 h累積釋放量不足3%、沒有突釋現(xiàn)象，釋藥144 h的累積釋放量達到50%，說明通過脂質(zhì)體與CS/β-GP溫敏水凝膠雙重包裹的肝素具有較好的緩釋作用；將優(yōu)化處方利用零級方程、一級方程、Higuchi模型及Ritger-Peppas模型進行釋藥行為擬合，結果表明，一級方程擬合的r較大，說明該方程能較好描述肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠的體外釋放性能，即釋藥特點是按時間變化先多后少的非恒速釋藥；同時肝素溫敏水凝膠的釋藥特性用Ritger-Peppas模型擬合亦較佳，且釋藥指數(shù)為0.529 2，藥物釋藥機制為擴散和溶蝕協(xié)同作用，主要為擴散作用。見圖1和表5。

圖1 肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠釋藥曲線Fig.1 Cumulative release curves of Hep from liposomes CS/β-GP thermosensitive hydrogels

表5 肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠中肝素釋藥模型擬合結果Tab.5 Hep liposomes thermosensitive hydrogels in vitro released in various models

3 討論

臨床上一般采用皮下注射肝素來治療DVT，能極大降低致死率[23]。但肝素半衰期短，緩釋效果不夠理想，藥效作用時間短，需連續(xù)多次注射才能有較好的治療效果，導致病人的順應性較差，且皮下注射易出現(xiàn)出血癥狀[8]。理想的肝素制劑應具備良好的生物相容性、可降解性、藥物緩釋及方便操作等性能，針對這一需求，本研究分析了一種緩釋制劑，將肝素制成脂質(zhì)體溫敏水凝膠，使藥物具有靶向性，控制藥物釋放速度，維持血藥濃度穩(wěn)定，增長藥效作用時間，減少藥物毒副作用，提高患者的依從性。

由于肝素是一種蛋白多糖，在紫外-可見區(qū)無紫外吸收[24]，所以本次實驗通過比色法來間接測定肝素的濃度，利用肝素與亞甲基藍在一定濃度范圍內(nèi)的褪色反應，建立紫外可見分光光度法進行方法學考察；考察亞甲基藍的濃度與肝素最大吸收波長，最終確定控制肝素于664 nm處有最大吸收峰，亞甲基藍的濃度為0.024 g/L。

本實驗采用薄膜分散-超聲法[25-26]制備肝素脂質(zhì)體，選用動態(tài)透析袋法進行體外釋放度測定。通過前期三因素三水平正交實驗，最終確定了卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為6 ∶1，卵磷脂與藥物的質(zhì)量比為10 ∶1，水化時間為1.5 h為最優(yōu)處方，制備的脂質(zhì)體具有最優(yōu)的釋藥效能，其釋藥特性用Higuchi模型和Ritger-Peppas模型擬合較好。在制備肝素脂質(zhì)體時，初步確定條件，考察溫度(30、40、50及60 ℃)的影響，當溫度較低時，肝素溶液不易將薄膜洗脫下來；溫度過高則影響其磷脂化，造成水化不完全，包封率較低，最終采用溫度為50 ℃。對離心轉速(2 000、4 000、6 000、8 000、1 000及12 000 r/min)進行了考察，轉速較小，脂質(zhì)體并不能有效分離，會造成包封率偏??；轉速過大，直接將以包裹的脂質(zhì)體破壞，造成藥物泄漏，包封率減小，較為嚴重的情況為達不到緩釋作用，最終確定轉速為8 000 r/min。卵磷脂與膽固醇的溶解采用有機溶劑。本實驗考察了三氯甲烷、二氯甲烷、甲醇及無水乙醇等，最后采用毒性較小且溶解效果較好的二氯甲烷溶解。

在制備溫敏水凝膠時，隨著CS與β-GP的質(zhì)量比減小，膠凝化過程縮短，這可能是β-GP為強堿弱酸鹽，增大β-GP的量，該體系中pH值增大，由冰醋酸溶解的CS顯酸性，使在體系中CS與β-GP結合的量增大，CS/β-GP間的靜電引力作用增強，從而使在生理狀態(tài)下，膠凝化過程縮短[22]。最終確定2%CS與56%β-GP為制備溫敏水凝膠的最佳質(zhì)量比。采用動態(tài)透析袋法進行體外釋放度測定，其釋藥特性用一級方程、Higuchi模型和Ritger-Peppas模型擬合較好，藥物釋藥機制按時間變化先多后少的非恒速釋藥，同時伴隨擴散和溶蝕，主要為擴散作用。在制備溫敏水凝膠的時候，考察了泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、海藻酸鈉及卡波姆940等緩釋材料，考慮到溫敏水凝膠的特殊性能，能隨環(huán)境溫度的改變而發(fā)生變化，最終選用殼聚糖作為凝膠載體。天然無毒可降解載體材料殼聚糖制備肝素溫敏水凝膠，加入β-GP對其結構進行修飾，常溫下具有可注射性，生理狀態(tài)下化為半固體，可實現(xiàn)局部定位緩慢釋放，發(fā)揮靶向制劑的作用，可維持血藥濃度，減少給藥劑量和次數(shù)，降低不良反應[27]。

通過將脂質(zhì)體與殼聚糖兩者的優(yōu)勢結合所制備的肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠，其體外釋藥特性用一級方程和Ritger-Peppas模型擬合較好，其釋藥特點按時間變化先多后少，其過程伴隨著溶蝕和擴散，以擴散作用為主。

綜上所述，本研究所制備肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠，結合脂質(zhì)體與水凝膠的優(yōu)勢，將其釋放性能更好地表現(xiàn)，為進一步開展體內(nèi)實驗打下基礎，同時也為研究局部注射用肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠提供科學依據(jù)。