楊漢蕾，趙敬，張科，鄢宇航，門萬琪，皮煥婷，牟榮*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 人體寄生蟲學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 現(xiàn)代病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550004)

微小膜殼絳蟲(Hymenolepisnana,H.nana)，又稱短膜殼絳蟲，屬于膜殼科膜殼屬[1]，是一種人獸共患寄生蟲，也是幼兒較常感染的一種絳蟲，通常被稱為“侏儒絳蟲”，是因其體積小，長2～4 cm、寬1 mm[2-4]。H.nana成蟲寄生于人或嚙齒類動物小腸，以頭節(jié)吸盤附著在腸絨毛間的黏膜表面[3]；當(dāng)H.nana性成熟時，末端孕節(jié)在腸道內(nèi)分離、解體，之后釋放出蟲卵，并通過糞便排出蟲卵；這些蟲卵會立即產(chǎn)生感染性，且可以在環(huán)境中存活長達(dá)兩周。據(jù)估計，全世界H.nana感染人數(shù)大約有50 000 000～75 000 000[5-6]。相關(guān)證據(jù)表明，H.nana感染具有改善腸炎的能力，其引起的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制能夠確定新的分子靶點(diǎn)，為炎癥性腸道疾病患者提供新的治療方案[7-9]。嚙齒類動物目前是實(shí)驗(yàn)性哺乳動物絳蟲研究的主要對象，尤其是小鼠[10]。因此，建立H.nana感染小鼠的實(shí)驗(yàn)動物模型可為后續(xù)開展H.nana所致炎癥性腸炎的相關(guān)研究提供動物模型。近年來，國內(nèi)外報道了一系列H.nana感染脊椎動物和節(jié)肢動物的動物模型[11-12]，為建立H.nana感染小鼠動物模型奠定了理論基礎(chǔ)，但是這些研究均缺少對小鼠體質(zhì)量變化以及腸組織病理變化的研究，且小鼠每克糞便蟲卵數(shù)(eggs per gram，EPG)檢測缺乏連續(xù)性和系統(tǒng)性。因此本實(shí)驗(yàn)通過將野生小鼠小腸獲取的H.nana，以不同蟲卵量實(shí)驗(yàn)感染ICR小鼠，觀測感染后不同時間小鼠的EPG、體質(zhì)量和小腸組織病理學(xué)特征及檢獲蟲體形態(tài)學(xué)特征，以了解H.nana在小鼠腸內(nèi)的生長發(fā)育情況和小鼠腸組織病理變化，為H.nana實(shí)驗(yàn)感染ICR小鼠的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲體來源、實(shí)驗(yàn)動物、主要試劑及儀器

蟲體采自野生小鼠，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子鑒定，確定采集蟲體為H.nana。6周齡ICR雌鼠購自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，體質(zhì)量26～28 g，體健，經(jīng)糞檢和間接凝集實(shí)驗(yàn)證實(shí)無寄生蟲感染。稱量體質(zhì)量后隔離飼養(yǎng)觀察3 d。嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)，飲水瓶與鼠糧不能交叉污染，每周清洗更換3次飼養(yǎng)籠、飼料和墊料。Trizol購自美國Sigma公司，PCR引物購自上海生工生物工程有限公司，Nikon科研級成像系統(tǒng)(日本Nikon公司，Nikon DS-RI2)，PCR擴(kuò)增儀(THCHNE，TC-512)、生物組織冷凍包埋機(jī)(BIOBAS EKD-BC，BK-BM)、生物組織切片機(jī)(德國徠卡，RM2016)。

1.2 H.nana蟲種鑒定

1.2.1形態(tài)學(xué)鑒定 將蟲體取出置于載玻片上，滴入生理鹽水使之舒展開，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察其成蟲和蟲卵的形態(tài)[13]。取兩載玻片將H.nana蟲體壓平，棉線纏緊，于70 %的酒精里固定后行醋酸明礬卡紅染色[14]，二甲苯透明后用中性樹膠封片，觀察并拍照。

1.2.2野生小鼠體內(nèi)獲取的蟲體分子生物學(xué)鑒定 取約5 mg成蟲，用酚氯仿法提取總DNA。以其為模板用COX1[15-17]特異性引物(COX1 上游引物5′-ACCGCGTCGTGTGTGTATTT-3′，COX1 下游引物5′-ACATGCAACTGGGCTCATACG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，推測結(jié)果為COX1產(chǎn)物條帶202 bp。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×TaqPCRMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 2 min，94 ℃ 40 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。使用1%的瓊脂糖凝膠電泳35 min，于紫外燈下觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)拍照。將PCR 產(chǎn)物送上海生工公司進(jìn)行測序，然后進(jìn)行序列分析。

1.3 H.nana蟲卵的收集和計數(shù)

取數(shù)段H.nana的末段孕節(jié)，生理鹽水反復(fù)沖洗后以眼科剪充分剪碎使蟲卵逸出，待蟲體組織沉淀后收集上清，光學(xué)顯微鏡下觀察收集的蟲卵[18]，分別計數(shù)5次蟲卵量后取均值，每次計數(shù)蟲卵懸液6 μL，最后定量為生理鹽水0.3 mL中含1 000個蟲卵備用。

1.4 分組

168只、6周齡、體質(zhì)量約26 g的ICR小鼠分為6組，5個實(shí)驗(yàn)組和1個對照組,每組28只。5個實(shí)驗(yàn)組分別以60、100、300、500、1 000個蟲卵灌胃感染,生理鹽水灌胃的小鼠作為對照組。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1一般情況與體質(zhì)量實(shí)驗(yàn)組和對照組每組隨機(jī)選8只小鼠標(biāo)記，每日觀察小鼠活動情況，連續(xù)記錄小鼠體質(zhì)量25 d，小鼠相對體質(zhì)量=小鼠體質(zhì)量/小鼠初始體質(zhì)量×100。

1.5.2糞檢蟲卵 使用改良加藤法[19]檢測檢測小鼠糞便EPG，連續(xù)檢測25 d，根據(jù)記錄結(jié)果作排卵趨勢圖。

1.5.3剖檢獲取蟲體觀測 小鼠在感染后第5、10、15、20、25 d，每組隨機(jī)選取5只小鼠麻醉處死，打開腹腔，取出小腸，放置于裝有預(yù)冷生理鹽水(0 ℃)的培養(yǎng)皿中10 min，然后解剖并收集蟲體，觀察腸內(nèi)H.nana的發(fā)育狀況。

1.5.4組織學(xué)觀察 感染后第5、10、15、20、25天，取 5個實(shí)驗(yàn)組和對照組的小腸，經(jīng)多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片并做蘇木精-伊紅染色(hymatoxylin-eosin stain，H&E stain)。

1.5.5腸組織的DNA提取 挑選出觀察到蟲體的蠟塊組織提取其中的總DNA，以其為模板利用COX1特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將石蠟包埋的組織切成厚10 μm的薄片，取10 張切片用二甲苯常規(guī)脫蠟后，使用75%酒精和無菌水各洗滌3次，然后采用酚氯仿法提取總DNA，DEPC水溶解后采用分光光度計測定DNA的濃度和純度[20-21]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 H.nana蟲種鑒定

將野生小鼠體內(nèi)獲得的蟲體置于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)蟲體頭節(jié)有4個吸盤以及一個可自由伸縮的頂突；劃破孕節(jié)使蟲卵逸出，可見卵殼較薄，胚膜兩端凸起發(fā)出絲狀物，內(nèi)有一六鉤蚴(圖1a、圖1b)；明礬醋酸卡紅染色后鏡下可清晰看到蟲體頂突上有一圈小鉤，成節(jié)內(nèi)有3個圓球形睪丸和發(fā)達(dá)的儲精囊(圖1c、圖1d)。此外，蟲體DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示在約200 bp位置有一特異性條帶，與分子生物學(xué)鑒定的COX1產(chǎn)物條帶為202 bp的預(yù)期結(jié)果大致相符(圖2)。同時PCR 產(chǎn)物測序及序列比對結(jié)果表明，所克隆的基因片段與GenBank中記錄的COX1參考株核苷酸序列同源性為99%。

注：a為蟲卵(400×)；b為成蟲(100×)；c為頭節(jié)(200×)，箭頭所示為小鉤；d為成熟節(jié)片(400×)；a、b為生理鹽水涂片，c、d為醋酸明礬卡紅染色。圖1 野生小鼠體內(nèi)獲取的微小膜殼絳蟲形態(tài)Fig.1 Morphology of H.nana in wild mice

注：M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1為COX1核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2 野生小鼠體內(nèi)獲取的蟲體DNA PCR擴(kuò)增圖Fig.2 PCR amplification of insect DNA obtained from wild mice

2.2 小鼠一般情況與體質(zhì)量

感染后第3天,小鼠出現(xiàn)精神萎靡、食量下降、活動減少、皮毛色澤變暗、毛發(fā)蓬亂等癥狀，癥狀隨蟲卵感染量加重。感染量為60、100和300個蟲卵的實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與對照組比較，感染量為500個蟲卵的實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量在感染后第2天明顯減輕(P<0.05)，感染量為1 000個蟲卵的實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量在感染后第2天和第7天也明顯減輕(P<0.05)。見圖3。

2.3 糞檢結(jié)果

不同蟲卵感染量的實(shí)驗(yàn)組小鼠，在感染后第12天從糞便中檢獲蟲卵，感染率為100%，證明蟲體在感染后第12天已經(jīng)發(fā)育成熟，完成一個生活史。感染500個蟲卵的實(shí)驗(yàn)組檢出蟲卵時間最早、排卵持續(xù)時間最長，H.nana感染ICR小鼠動物模型建立可參考該感染量，見表1。

表1 各組H.nana感染ICR小鼠糞檢蟲卵情況Tab.1 The results of eggs detected from the feces of ICR mice infected with H.nana

注：(1)與對照組比較，P<0.05。圖3 實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠的相對體質(zhì)量Fig.3 Relative weight of mice in experimental group and control group

2.4 剖檢蟲體觀測

感染后第5天未檢獲蟲體。感染后第10天感染量為60個蟲卵的實(shí)驗(yàn)組有3只小鼠檢獲蟲體，成蟲檢獲率60%；感染量為100、300、500、1 000個蟲卵的實(shí)驗(yàn)組小鼠均檢獲蟲體，成蟲檢獲率100%，蟲體主要分布于距回盲部6～12 cm處的小腸內(nèi)。感染后第15、20、25天所有實(shí)驗(yàn)組小鼠小腸內(nèi)均發(fā)現(xiàn)成蟲，成蟲檢獲率100%，蟲體主要分布于距回盲部1～8 cm處的小腸內(nèi)。見圖4。

注：箭頭A所指為H.nana蟲體，箭頭B所指為回腸末端。圖4 感染小鼠小腸內(nèi)獲取的微小膜殼絳蟲成蟲Fig.4 Adult H.nana isolated from the small intestine of infected mice

2.5 小腸組織觀察及蠟塊組織PCR檢測

2.5.1小腸組織觀察 感染第5天感染量為1 000個蟲卵的實(shí)驗(yàn)組及感染第15天60個蟲卵的實(shí)驗(yàn)組小鼠的組織切片中發(fā)現(xiàn)，小鼠后三分之一的小腸黏膜內(nèi)含有似囊尾蚴(圖5a)，在腸絨毛之間發(fā)現(xiàn)帶有吸盤和鉤狀物的成蟲頭節(jié)和頭節(jié)后未分節(jié)的細(xì)長頸部(圖5b、圖5c)、以及含有雌雄生殖系統(tǒng)的成蟲節(jié)片(圖5d)，認(rèn)為H.nana從幼蟲到成蟲的發(fā)育過程是一個從腸壁逐漸向腸腔的遷移過程。與對照組比較，感染后25 d內(nèi)實(shí)驗(yàn)組H.nana感染處腸組織病理切片均未觀察到損傷修復(fù)肉芽腫組織，但是炎癥細(xì)胞增多，特別是嗜酸性粒細(xì)胞增多明顯。

2.5.2小腸蠟塊組織的PCR檢測 結(jié)果約200 bp有一特異性條帶，與分子生物學(xué)鑒定的COX1產(chǎn)物條帶為202 bp的預(yù)期結(jié)果大致相符(圖6)，表明小鼠腸道內(nèi)寄生的確為H.nana。

注：a箭頭所示為似囊尾蚴(400×)，b箭頭所示為成蟲頭節(jié)(200×)，c箭頭所示為成蟲頭節(jié)和頸部(200×)，d為成蟲成熟節(jié)片(100×)。圖5 微小膜殼絳蟲感染小鼠小腸組織切片(HE)Fig.5 Section of small intestine in mice infected with H.nana(HE)

注：M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1為COX1核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。圖6 感染組小鼠小腸蠟塊組織的PCR擴(kuò)增情況Fig.6 PCR detection of intestinal tissue of the worm found in HE staining section

3 討論

H.nana是一種常見的絳蟲，分布于世界各地，主要發(fā)現(xiàn)于發(fā)展中國家的兒童體內(nèi)。人類膜殼絳蟲病是一種全球性流行的人畜共患病，由H.nana和縮小膜殼絳蟲引起[22]。H.nana在亞洲、南歐和東歐、中美洲和南美洲以及非洲流行，其生活在人類、小鼠和大鼠的小腸中，它主要通過含有卵的糞便或以中間宿主昆蟲為載體進(jìn)行傳播。H.nana也能夠在一個宿主中完成其整個生命周期，因此能夠自體感染。張維真等[23]研究報道，H.nana蟲卵孵化出六鉤蚴的時間大約需要2～ 3 d。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，感染量為60～1 000個鼠源性H.nana蟲卵均能感染ICR小鼠,且感染后第2天，500個蟲卵感染量和1 000蟲卵感染量的實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量均較對照組明顯減輕。結(jié)合張維真等[23]所報道的結(jié)果，推測感染后第2天H.nana蟲卵孵化出六鉤蚴后鉆入小鼠腸絨毛對其造成損傷，同時蟲卵孵化過程中的代謝分泌物也會刺激小鼠腸壁，導(dǎo)致腸壁吸收功能障礙，從而使感染組小鼠體質(zhì)量下降。本實(shí)驗(yàn)糞檢蟲卵的結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠的感染率為100%，蟲體在感染后約第12天發(fā)育成熟，這與Thompson[24]研究中所報道的約2周時間相符合，其中感染500個蟲卵的實(shí)驗(yàn)組蟲體和蟲卵檢獲時間一致性最高，反應(yīng)了蟲體發(fā)育狀況良好。500個蟲卵感染量的實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)蟲體發(fā)育良好的原因可能是小鼠體型較小，其腸道無法負(fù)擔(dān)過多的蟲卵感染有關(guān)；本研究中也發(fā)現(xiàn)1 000個蟲卵感染量的實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量下降更明顯，排卵持續(xù)時間反而更短。因此適量的蟲卵感染量可維持H.nana與小鼠相互作用的平衡關(guān)系，一方面小鼠的自身免疫力不會完全清除感染的蟲卵，另一方面部分蟲卵可以在小鼠小腸內(nèi)繼續(xù)生長發(fā)育成熟。Fan等[12]曾報道以20個H.nana蟲卵感染小鼠，感染19～33 d后檢測的成蟲感染率僅為33%。因此可將500個蟲卵感染量作為參考以建立H.nana感染ICR小鼠動物模型。

本實(shí)驗(yàn)的組織病理切片結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)組小鼠距離回盲部1～12 cm處的小腸內(nèi)可見似囊尾蚴、成蟲頭節(jié)、頸部以及成蟲節(jié)片，腸粘膜未見損傷修復(fù)肉芽腫組織，但是炎癥細(xì)胞增多，尤以嗜酸性粒細(xì)胞增多明顯，這與Hench等[10]報道的情況基本一致，在檢測中并沒有發(fā)現(xiàn)與宿主排斥反應(yīng)有關(guān)的變化，如組織正常結(jié)構(gòu)的喪失、水腫、混合細(xì)胞浸潤或上皮糜爛，但是炎癥性細(xì)胞明顯增多。從進(jìn)化角度來說，寄生蟲對宿主的傷害越小越好。Hench等[10]的研究是基于1例自然感染的病患，而本實(shí)驗(yàn)是取野生小鼠體內(nèi)的H.nana蟲卵感染ICR小鼠。有研究報道，人、嚙齒類動物的H.nana雖屬于同種生物，但其生理型并不相同，當(dāng)改變宿主后其生理型會逐漸改變，這其中的機(jī)制尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計尚存在不足之處，實(shí)驗(yàn)過程中可能存在自體感染的問題，比如感染后12 d，有可能存在自身感染，這對后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析會造成干擾，因此今后在建立H.nana實(shí)驗(yàn)感染ICR小鼠動物模型時可以將實(shí)驗(yàn)時間控制在12 d以內(nèi)，來排除自體感染的干擾，以利于開展進(jìn)一步的相關(guān)研究。