楊漢蕾，趙敬，張科，鄢宇航，門萬琪，皮煥婷，牟榮*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 人體寄生蟲學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 現(xiàn)代病原生物學(xué)特色重點實驗室，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550004)

微小膜殼絳蟲(Hymenolepisnana，H.nana)是人類常見感染的絳蟲，其成蟲可寄生于人或鼠類小腸[1]，能夠在一個宿主中完成整個生命周期，因此能夠自體感染[2]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)腸道寄生蠕蟲在破壞小腸組織完整性的同時也產(chǎn)生積極的損傷修復(fù)作用[3-4]。由小腸的穩(wěn)態(tài)機(jī)制提示小腸干細(xì)胞在維持腸道正常生理功能及組織結(jié)構(gòu)的重要作用[5]，但關(guān)于腸道寄生蠕蟲感染與小腸干細(xì)胞的關(guān)系研究并不多見，因此本研究在前人的研究基礎(chǔ)上篩選出幾個腸干細(xì)胞相關(guān)基因，G蛋白偶聯(lián)受體5基因(leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor5，Lgr5)[6]、Bmi1多梳復(fù)合蛋白基因(Bmi1 proto-oncogene polycomb ring finger，Bmi1)[7]、Msi1武藏RNA結(jié)合蛋白基因(musashi RNA-binding protein 1，Msi1)等干細(xì)胞標(biāo)記物[8]及淋巴細(xì)胞抗原6復(fù)合物基因(lymphocyte antigen 6 complex locus A，Ly6a)[9-10]。Lgr5蛋白在體內(nèi)分布廣泛，如腦、眼、脊髓、卵巢及胃腸道等都有一定的表達(dá)[11]；Lgr5在器官、胚胎和其他一些生理過程中，以及成體干細(xì)胞的自我更新和維持中起著非常重要的作用，其在小腸和結(jié)腸隱窩基底柱狀上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)，基因編碼產(chǎn)物為陽性的細(xì)胞，可以分化產(chǎn)生腸上皮所有的細(xì)胞類群[12]；經(jīng)研究證實Lgr5為小腸和結(jié)直腸干細(xì)胞標(biāo)記基因，表達(dá)量的增加能夠促進(jìn)胃腸黏膜的自我更新能力[6]。Bmil是最早發(fā)現(xiàn)的+4位腸干細(xì)胞標(biāo)記基因，是Polycomb基因家族的一部分，該基因在胎盤、大腦及心臟中廣泛表達(dá)，對干細(xì)胞的自我更新以及腫瘤的發(fā)生起著重要作用[13-14]；通過譜系追蹤技術(shù)證明，Bmi1能標(biāo)記少量慢速增殖的+4位腸干細(xì)胞，這些細(xì)胞可增殖、擴(kuò)張及自我更新，形成所有已分化的小腸上皮細(xì)胞譜系[7]；有研究認(rèn)為Bmil干細(xì)胞誘導(dǎo)腸上皮損傷后修復(fù)[15]。Msil是一種進(jìn)化十分保守的RNA結(jié)合蛋白，在維持干細(xì)胞自我更新、分化和腫瘤發(fā)生方面起著重要作用[16]；在哺乳動物小腸中，Msi1在距隱窩基底部4～6個細(xì)胞處表達(dá)，與公認(rèn)的小腸干細(xì)胞位置相符，Msil在哺乳動物體內(nèi)參與了包括維持干細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞分化及腫瘤形成等一系列的調(diào)控[17]，因此Msil也可以作為小腸干細(xì)胞的標(biāo)志物。Ly6a編碼的干細(xì)胞抗原-1(stem cell antigen-1,Sca-1)在化學(xué)性結(jié)腸炎模型的研究中被證明起動態(tài)調(diào)節(jié)作用，相比于正常腸組織，Sca-1表達(dá)并不明顯，而在損傷腸組織中，腸上皮修復(fù)相關(guān)的腫脹區(qū)域Sca-1表達(dá)水平顯著增高[18]；此外，當(dāng)損傷部位僅在絨毛而不涉及隱窩時，Ly6a表達(dá)并不上調(diào)[3]；因此，Ly6a一般被當(dāng)做腸道隱窩損傷的特異性標(biāo)志物。本實驗擬在建立H.nana實驗感染動物模型的基礎(chǔ)上，采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)技術(shù)檢測感染H.nana的ICR小鼠腸組織干細(xì)胞相關(guān)基因Lgr5、Bmi1、Msi1及Ly6a的表達(dá)，為探索H.nana感染所致宿主腸壁損傷后的修復(fù)機(jī)制提供有意義的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1蟲體來源和實驗動物 蟲體采自貴陽花溪山區(qū)野生小鼠，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，確定采集蟲體為H.nana，收集成蟲孕節(jié)及蟲卵。6周齡美國癌癥研究所(institute of cancer research，ICR)雌鼠60只，購自貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，體質(zhì)量26～28 g，體健，經(jīng)糞檢和間接凝集實驗證實無寄生蟲感染；稱重后隔離飼養(yǎng)觀察3 d，無健康問題后可作實驗用；實驗期間小鼠嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)，水瓶與鼠糧不能交叉污染，每周清洗更換3次飼養(yǎng)籠及飼料、墊料。

1.1.2主要試劑和儀器 Trizol(美國invitrogen)，qRT-PCR引物(上海生工生物工程有限公司合成)；Nikon科研級成像系統(tǒng)(日本Nikon，Nikon DS-RI2)，ABI7300 熒光定量PCR儀(美國 ABI，7300)，生物組織切片機(jī)(德國徠卡，RM2016)。

1.2 方法

1.2.1H.nana形態(tài)學(xué)鑒定及分子生物學(xué)鑒定 取出野生小鼠小腸內(nèi)獲取的的蟲體置于培養(yǎng)皿，生理鹽水沖洗3次，取載玻片滴入生理鹽水，用棉簽將蟲體挑到玻片上，使蟲體舒展開，置于400倍顯微鏡下觀察成蟲及蟲卵的形態(tài)；根據(jù)GenBank中記錄的COX1全基因序列設(shè)計保守引物[19-20]，提取蟲總DNA，以其為模板利用保守引物擴(kuò)增PCOX1，引物序列：PCOX1 Forward Primer為5′-ACCGCGTCGTGTGTGTATTT-3′，PCOX1 Reverse Primer為5′-ACATGCAACTGGGCTCATACG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)測大小202 bp。使用1%的瓊脂糖凝膠電泳35 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照。將PCR 產(chǎn)物送上海生工公司進(jìn)行測序，然后將測得序列與GenBank中記錄的COX1序列進(jìn)行blast比對分析。

1.2.2實驗動物感染、分組及標(biāo)本采集 60只ICR小鼠隨機(jī)均分為實驗組和對照組，H.nana蟲卵淘洗定量后，實驗組ICR小鼠灌胃500個蟲卵，對照組小鼠灌胃等量生理鹽水。感染后第1天開始，每天分別隨機(jī)處死實驗組小鼠和對照組小鼠各3只，取距離回盲部6～8 cm處小腸組織，同時記錄實驗組小鼠小腸組織內(nèi)蟲體檢獲情況并計算蟲體檢獲率[蟲體檢獲率=(當(dāng)天檢獲蟲體的小鼠數(shù)/3)×100%]，共10 d。

1.2.3小鼠小腸目的基因的qRT-PCR檢測 利用 Primer 5.0 和 DNA Club 軟件根據(jù)Lgr5、Bmi1、Msi1及Ly6a各基因的 cDNA 序列設(shè)計 qRT-PCR特異性引物，同時以GAPDH基因為內(nèi)參基因(引物序列見表 3)，交由上海生工生物公司合成。反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL，上游引物 0.8 μL，下游引物 0.8 μL，ROX Reference DyeⅠ(50×)0.4 μL，c DNA 1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s、95 ℃變性5 s及60 ℃退火34 s，共40個循環(huán)，最后72 ℃延伸30 s。采用2-ΔΔCT法計算各目的基因的相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR 引物及產(chǎn)物大小Tab.1 Primers used in qRT-PCR

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 H.nana形態(tài)學(xué)鑒定及分子生物學(xué)蟲種鑒定

顯微鏡下觀察野生小鼠小腸內(nèi)獲得的蟲體，可見蟲體頭節(jié)有4個吸盤以及一個可自由伸縮的頂突；劃破孕節(jié)使蟲卵逸出，可見蟲卵卵殼較薄，胚膜兩端凸起發(fā)出絲狀物，內(nèi)有一六鉤蚴(圖1)。提取該蟲總DNA，以其為模板利用保守引物擴(kuò)增PCOX1，結(jié)果在200 bp處有一特異性條帶，與202 bp的預(yù)期結(jié)果大致相符(圖2)；PCOX1序列與 GenBank 中登錄的COX1參考株核苷酸序列同源性為99%(圖3)。

圖3 COX1基因擴(kuò)增產(chǎn)物同源性分析結(jié)果Fig.3 Homology analysis of COX1 amplified products

蟲卵(400×) 成蟲(40×)注：箭頭所示為蟲卵。圖1 野生小鼠體內(nèi)檢獲H.nana蟲卵及成蟲的形態(tài)學(xué)特征(糞便生理鹽水涂片)Fig.1 Morphological characteristic of H.nana worms from wild mice(fecal physiological saline smear)

注：M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1為COX1核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2 COX1基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoretogram of COX1 amplification products

2.2 H.nana蟲卵實驗感染小鼠

感染后第7～10天，實驗組小鼠距離回盲部6～12 cm處小腸內(nèi)均檢獲白色細(xì)小蟲體，鏡下可分辨出有4吸盤的頭節(jié)和頸部(圖4)，蟲體檢獲率100%；實驗組小鼠小腸內(nèi)均未檢獲蟲體。

圖4 H.nana感染小鼠后第7天小鼠小腸內(nèi)檢獲的蟲體(生理鹽水涂片，×40)Fig.4 The worm in the small intestine of mice infected with H.nana on the 7th day(Saline smear，×40)

2.3 qRT-PCR檢測ICR小鼠小腸組織干細(xì)胞相關(guān)基因mRNA的相對表達(dá)

感染H.nana后第1～10天，實驗組和對照組ICR小鼠干細(xì)胞相關(guān)基因mRNA的相對表達(dá)量結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組ICR小鼠Lgr5 mRNA在感染后第1天(即H.nana似囊尾蚴期)有一過性的高表達(dá)(P<0.05)、感染后第5～8天即H.nana成蟲期表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)；與對照組相比，實驗組ICR小鼠Bmi1 mRNA在感染后第1天(即H.nana似囊尾蚴期)有一過性的高表達(dá)(P<0.05)、感染后第6～8天即H.nana成蟲期表達(dá)下降(P<0.05)；實驗組ICR小鼠Msi1 mRNA在感染后第一天表達(dá)有一過性上升但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，第2～3天和第6～10天即H.nana似囊尾蚴期和成蟲期表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)；與對照組相比，實驗組ICR小鼠Ly6amRNA在感染后第2天(即H.nana似囊尾蚴期)表達(dá)呈一過性下降(P<0.05)、感染后第6～10天(即成蟲期)表達(dá)明顯上升(P<0.01)。見圖5。

3 討論

H.nana是一種古老的人獸共患寄生蟲，蟲體頂突上有一圈單層排列的小鉤，該結(jié)構(gòu)幫助其牢牢附著在宿主腸壁組織上，從而給宿主造成嚴(yán)重的機(jī)械損傷，成蟲附著的部位，腸黏膜發(fā)生壞死，深達(dá)肌層，并有淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤[2]。研究發(fā)現(xiàn)腸道寄生蠕蟲可能具有誘導(dǎo)腸隱窩的新機(jī)制的損傷修復(fù)方式[21]。Nusse等[3]在使用多形類卷體線蟲(Heligmosomoidespolygyrus)感染小鼠發(fā)現(xiàn)幼蟲肉芽腫上腸隱窩增生明顯，但是腸干細(xì)胞基因如Lgr5表達(dá)下降，該過程與腸隱窩損傷標(biāo)志物Sca1表達(dá)顯著增加有關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)H.nana感染ICR小鼠后似囊尾蚴期編碼組織損傷因子Sca-1的基因Ly6a表達(dá)有一過性下降，腸干細(xì)胞相關(guān)基因Lgr5和Bmi1表達(dá)上升，而在成蟲期Ly6a表達(dá)持續(xù)上升，腸干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)Lgr5、Bmi1及Msi1均顯著下降。H.nana的致病作用主要是由于成蟲頭節(jié)上的小鉤和體表微毛對宿主腸壁的機(jī)械損傷以及蟲體的毒性分泌物所致[2]。動物實驗結(jié)果顯示從感染第6天開始，H.nana的似囊尾蚴穿破腸絨毛回到腸腔，以頭節(jié)吸盤固著在腸壁上，逐漸發(fā)育為成蟲，對腸黏膜造成機(jī)械損傷，引起炎癥反應(yīng)，所以推測感染后第6～8天Ly6a基因呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)，可能與似囊尾蚴穿破腸絨毛回到腸腔引起腸黏膜的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。

注：A、B、C及D分別為Lgr5、Bmi1、Msi1 及Ly6a mRNA相對表達(dá)量；與對照組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖5 ICR小鼠小腸中干細(xì)胞相關(guān)基因mRNA的相對表達(dá)Fig.5 Relative mRNA expression of stem cell-related genes in small intestine of ICR mice

本實驗發(fā)現(xiàn)在感染成蟲期，無論是快速增殖干細(xì)胞基因Lgr5，還是緩慢增殖干細(xì)胞基因Bmi1和Msi1表達(dá)均顯著下降。Lgr5+干細(xì)胞是位于腸隱窩基底的快速增殖干細(xì)胞，其在腸道正常的生理代謝以及損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用，當(dāng)腸粘膜受到損傷時，Lgr5+干細(xì)胞迅速作出反應(yīng)，快速增殖分化為各種腸上皮細(xì)胞類型，對腸上皮損傷進(jìn)行損傷修復(fù)[5]。持續(xù)的損傷造成Lgr5+腸干細(xì)胞數(shù)目減少，這也許是快速增殖腸干細(xì)胞的一個特性。有研究發(fā)現(xiàn)在硫酸葡聚糖(disuccinimidyl suberate，DSS)誘導(dǎo)腸道炎癥的早期階段，Lgr5+腸干細(xì)胞的增殖會顯著加快，其分化的子代細(xì)胞增多，而在炎癥后期，小腸和結(jié)腸的Lgr5+腸干細(xì)胞的數(shù)目顯著減少[22]。當(dāng)損傷較重Lgr5+腸干細(xì)胞不足以補充腸組織正常結(jié)構(gòu)時，Bmi1+干細(xì)胞和Msi1+干細(xì)胞快速增殖，產(chǎn)生新的快速增殖干細(xì)胞，從而對腸上皮進(jìn)行修復(fù)[23]。本實驗結(jié)果顯示Bmi1和Msi1在成蟲期表達(dá)顯著下降，推測在H.nana感染ICR小鼠損傷修復(fù)過程中也存在其他未知因子發(fā)揮作用，抑制了干細(xì)胞基因的表達(dá)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。有研究發(fā)現(xiàn)在腸道受輻射誘導(dǎo)的炎癥階段Msi1和Msi2表達(dá)上升[24]，與本研究正好相反，可能是由于損傷誘導(dǎo)方式的不同以及Msi1在不同組織表達(dá)模式不同所致。推測輻射誘導(dǎo)的損傷腸道涉及基因突變，為避免將突變基因遺傳下去，休眠的緩慢增殖干細(xì)胞會被激活，而H.nana感染主要對腸道造成機(jī)械性損傷，損傷修復(fù)模式及主要應(yīng)答細(xì)胞也可能不同[25]。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)H.nana感染可明顯影響小鼠小腸組織Lgr5、Bmi1、Msi1及Ly6amRNA水平，基因表達(dá)差異主要分2個階段，分別對應(yīng)H.nana發(fā)育的似囊尾蚴階段和成蟲階段。下一步可使用條件性基因敲除或敲除技術(shù)，對干細(xì)胞相關(guān)基因在H.nana感染ICR小鼠的腸道損傷修復(fù)過程中所起的調(diào)節(jié)作用作進(jìn)一步研究。