石紅娟，茹笑影，劉玉琪，鄭 蕓，伍旭輝，黃 洋，李廣麗，江東能

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院//2.廣東省名特優(yōu)魚(yú)類生殖調(diào)控與繁育工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088；3.金湖縣人民醫(yī)院，江蘇 淮安 211600）

下丘腦是調(diào)節(jié)機(jī)體和內(nèi)分泌活動(dòng)的重要神經(jīng)中樞，也是神經(jīng)內(nèi)分泌的重要樞紐。作為一個(gè)重要的內(nèi)分泌器官，下丘腦直接分泌多種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，調(diào)控垂體中激素的分泌及其靶腺的活動(dòng)，包括體溫控制、睡眠、生理節(jié)律、生殖和生長(zhǎng)等[1-3]。性類固醇激素雌激素在動(dòng)物的生殖和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演重要的角色。在哺乳類，雌激素參與調(diào)控雌性卵巢生殖細(xì)胞囊破裂和初級(jí)濾泡形成[4]。在鳥(niǎo)類、爬行類、兩棲類和魚(yú)類等低等脊椎動(dòng)物，雌激素是參與性別決定與分化的重要因子[5-9]。此外，雌激素還參與調(diào)控機(jī)體生長(zhǎng)激素（Growth hormone，GH）的合成與分泌。在人類，雌激素17β-雌二醇（17β-Estradiol，E2）能顯著上調(diào)垂體中生長(zhǎng)激素GH的分泌[10]。在魚(yú)類，雌激素也能調(diào)控垂體中GH的合成和分泌[11-13]。在尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）、馬蘇大馬哈魚(yú)（Oncorhynchus masou）和黑頭軟口鰷（Pimephales promelas）和金錢魚(yú)（Scatophagus argus）中，高濃度雌激素E2或17α-乙炔雌二醇（17α-Ethinylestradiol，EE2）處理顯著上調(diào)雌魚(yú)垂體中g(shù)hmRNA表達(dá)[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射E2能顯著上調(diào)金錢魚(yú)垂體中g(shù)hmRNA的表達(dá)[15]，但在體注射雌激素對(duì)下丘腦中基因表達(dá)的影響研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

金錢魚(yú)隸屬于鱸形目（Perciformes）金錢魚(yú)屬（Scatophagus），主要分布在太平洋和印度洋，是我國(guó)東南沿海地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)品種。金錢魚(yú)肉質(zhì)鮮嫩，富含多種的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可為人體提供多種不飽和脂肪酸[14-18]。此外，金錢魚(yú)個(gè)體適中、性成熟年齡短，具有明顯的雌、雄生長(zhǎng)二態(tài)性，雌魚(yú)快于雄魚(yú)。與此相一致，金錢魚(yú)生長(zhǎng)激素gh呈二態(tài)性表達(dá)，雌魚(yú)垂體中g(shù)h表達(dá)顯著高于雄魚(yú)[13]。在金錢魚(yú)人工養(yǎng)殖過(guò)程中，雌、雄魚(yú)性腺發(fā)育不同步，雌魚(yú)卵泡不能充分發(fā)育成熟，需要施加適量催產(chǎn)素進(jìn)行催產(chǎn)。因此，本研究通過(guò)開(kāi)展轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析雌激素在體注射后對(duì)雌性金錢魚(yú)下丘腦中基因表達(dá)的影響，以期為金錢魚(yú)生長(zhǎng)二態(tài)性和卵泡發(fā)育的機(jī)制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)所用的12尾2齡雌性金錢魚(yú)均購(gòu)于廣東省珠海市育成魚(yú)苗養(yǎng)殖有限公司，在廣東海洋大學(xué)東海島生物研究基地養(yǎng)殖。

1.2 活體注射外源雌激素

將雌性金錢魚(yú)隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組和E2（Sigma-Aldrich，美國(guó)）注射組。其中E2組金錢魚(yú)腹腔注射4.0 g/L的E2乙醇溶液，每克體質(zhì)量注射1 μL，對(duì)照組雌魚(yú)注射等劑量無(wú)水乙醇。6 h后麻醉解剖，取下丘腦樣品，液氮速凍，操作結(jié)束后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存，用于提取下丘腦總RNA、進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 提取總RNA

按照Trizol試劑盒（Invitrogen，美國(guó)）說(shuō)明 書(shū)[14]提取雌魚(yú)下丘腦總RNA。取1 μL總RNA用于質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，另取1 μL總RNA，利用Nanodrop 2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀（Thermo Scientific，美國(guó)），測(cè)定濃度和質(zhì)量，其余總RNA置于-80 ℃保存，備用。

1.4 RNA樣品檢測(cè)、文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

RNA樣品的純度、濃度和完整性檢測(cè)合格后，構(gòu)建文庫(kù)，具體流程如下：1）按照VAHTS?mRNA-seq V3 Library Prep Kit for Illumina試劑盒（諾唯贊，中國(guó)）說(shuō)明書(shū)，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA；2）加入Fragmentation緩沖液將mRNA進(jìn)行隨機(jī)打斷；3）以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA聚合酶I合成第二條cDNA鏈，利用AMPure XP beads純化cDNA；4）純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，然后用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇；5）最后通過(guò)PCR富集得到cDNA文庫(kù)。然后，分別使用Qubit 2.0和Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的濃度和插入片段大?。↖nsert Size）進(jìn)行檢測(cè)，使用qPCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫(kù)質(zhì)量。待庫(kù)檢合格后，用HiSeq X-ten進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為PE150。

1.5 差異表達(dá)基因篩選

HiSeq X-ten高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，獲得以FASTQ格式存儲(chǔ)的Raw Data，通過(guò)測(cè)序質(zhì)量控制得到了Clean Data。然后，使用HISAT2比對(duì)系統(tǒng)將每個(gè)文庫(kù)中的Clean reads與金錢魚(yú)參考基因組（數(shù)據(jù)尚未公布，基因組大小為572.42 Mb，Contig N50 19.60 Mb，預(yù)測(cè)到24 256個(gè)基因）進(jìn)行比對(duì)及后續(xù)的分析。利用RPKM（the reads per kb per million reads）法[19]計(jì)算每個(gè)基因在不同樣本中的表達(dá)量。測(cè)序差異基因的檢測(cè)方法，參照文獻(xiàn)[20]對(duì)金錢魚(yú)E2注射組和對(duì)照組進(jìn)行差異表達(dá)分析。使用錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（False Discovery Rate，F(xiàn)DR）來(lái)調(diào)整所得的P值的閾值，將|log2(FC)|≥1且FDR≤0.05作為差異表達(dá)基因檢測(cè)過(guò)程中的篩選標(biāo)準(zhǔn)。其中對(duì)照組金錢魚(yú)下丘腦轉(zhuǎn)錄組中RPKM≤1的基因，都?xì)w為本底表達(dá)基因（background expression），不再進(jìn)行后續(xù)分析；RPKM＞1，-1＜log2(FC)＜1且FDR＞0.05的基因歸為無(wú)差異表達(dá)基因（nondifferentially expressed genes）；而RPKM＞1，|log2(FC)|≥1且FDR≤0.05的基因歸為上調(diào)（up-regulated）/下調(diào)（down-regulated）表達(dá)基因。

1.6 差異表達(dá)基因功能注釋和通路富集分析

將篩選獲得的差異基因，通過(guò)百邁客在線云平臺(tái)（http://www.biocloud.net/），在線對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行MA圖、火山圖、GO功能注釋和KEGG通路富集分析。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantity PCR，qPCR）驗(yàn)證差異表達(dá)基因

此實(shí)驗(yàn)所用的所有引物見(jiàn)表1。利用Primer 5.0設(shè)計(jì)差異基因prl、pgr特異的熒光定量引物，cyp19a1b、3β-HSDI和生長(zhǎng)相關(guān)基因ghrh、sst1、sst3、sst5、sst6的引物序列參照[14-15,18]。采用qPCR檢測(cè)雌性金錢魚(yú)下丘腦中差異基因的表達(dá)。qPCR反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche，瑞士）上進(jìn)行，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：反應(yīng)體系及程序設(shè)定參照文獻(xiàn)[15]。β-actin為內(nèi)參基因。運(yùn)用2-ΔΔCt方法計(jì)算差異基因的相對(duì)表達(dá)量。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD），6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較，檢驗(yàn)的顯著性概率臨界值為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 下丘腦轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量評(píng)估

金錢魚(yú)下丘腦轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，總共獲得Raw bases數(shù)目為57 019 996 730，高質(zhì)量純凈序列Clean reads為190 909 756。測(cè)序質(zhì)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，測(cè)序的質(zhì)量值20（Q20）百分比均超過(guò)98%，質(zhì)量值30（Q30）百分比均超過(guò)94%，GC含量所占比例在47.93%～48.38%（表2）。測(cè)序質(zhì)量總體較好，可進(jìn)行后續(xù)研究分析。

2.2 E2處理雌性金錢魚(yú)下丘腦轉(zhuǎn)錄組分析

基因注釋的結(jié)果顯示，基于NR、Swissprot、KOG、KEGG和GO等 6個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)基因序列比對(duì)，共注釋到金錢魚(yú)下丘腦中17 687個(gè)基因，采用 EBSeq 軟件分析獲得對(duì)照組、E2注射組的差異表達(dá)基因集（RPKM＞1，|log2(FC)|≥1和FDR≤0.05），結(jié)果顯示篩選到22個(gè)差異表達(dá)基因，包括11個(gè)表達(dá)上調(diào)基因，11個(gè)表達(dá)下調(diào)基因，將篩選出來(lái)的差異表達(dá)基因繪制MA圖及火山圖（圖1 A、B）。

圖1 差異基因表達(dá)情況Fig.1 Differences of genes expression

2.3 E2注射雌性金錢魚(yú)下丘腦中差異表達(dá)基因的篩選

基于E2注射組和對(duì)照組雌魚(yú)下丘腦中基因RKPM值變化倍數(shù)，篩選到22個(gè)差異表達(dá)基因：prl（催乳素）、erf3α（真核肽鏈釋放因子3α）、pde6h（磷酸二酯酶6H，cGMP特異，視錐，γ）、pgr（孕激素核受體）、lingo3（富含亮氨酸重復(fù)序列和免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的與Nogo受體相互作用蛋白3）、zbtb4（鋅指與btb結(jié)構(gòu)域蛋白4）、cyp19a1b（細(xì)胞色素p450家族19亞家族a多肽1b）、nlrc3（核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3）、3β-HSD I（3β-羥類固醇脫氫酶Ⅰ）、arntl（芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白）、pcdhαc2（原鈣黏蛋白α-c2）、chsy1（硫酸軟骨素合酶）、muc17l（黏蛋白17樣蛋白）、prf1（穿孔素1）、hla-α（MhcⅠ類抗原）、nlrp12（Nacht富亮氨酸重復(fù)序列和Pyd結(jié)構(gòu)域）、kcnt1（Na＋激活K＋通道）、tprg1l（腫瘤蛋白p63調(diào)節(jié)類因子1）、ifi44l（干擾素誘導(dǎo)蛋白44樣蛋白）、cntn3（接觸蛋白3）、scocob（短卷曲螺旋蛋白）和1個(gè)尚未注釋基因（表3）。

表3 篩選差異表達(dá)基因Table 3 Filter differentially expressed genes

2.4 E2注射雌性金錢魚(yú)下丘腦中差異表達(dá)基因功能富集分析

基因GO功能富集分析結(jié)果顯示，涉及生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能這3大功能分類中54個(gè)功能小類。其中，差異基因涉及的生物過(guò)程有8個(gè)，包括細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程、發(fā)育過(guò)程等；細(xì)胞組分6個(gè)，包括細(xì)胞、細(xì)胞組分、膜組分等；分子功能2個(gè)，包括結(jié)合、催化活性等（圖2）。

圖2 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析Fig.2 GO enrichment analysis of differential expression genes

圖3 差異表達(dá)基因的KEGG功能富集分析Fig.3 KEGG enrichment analysis of differential expression genes

進(jìn)一步通過(guò)KEGG系統(tǒng)分析差異基因涉及的代謝途徑結(jié)果（圖3）顯示，E2處理雌性金錢魚(yú)下 丘腦轉(zhuǎn)錄組中的差異表達(dá)基因參與生物系統(tǒng)、人類疾病、環(huán)境信息處理、代謝、細(xì)胞過(guò)程和遺傳遺傳信息處理6大類，孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、單純皰疹感染、細(xì)胞黏附分子、嘌呤代謝等13小類代謝通路。

2.5 E2對(duì)金錢魚(yú)下丘腦中性類固醇激素和生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)的影響

與下丘腦轉(zhuǎn)錄組結(jié)果相一致，qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照雌魚(yú)相比，E2注射組雌魚(yú)下丘腦中prl、pgr、cyp19a1b和3β-HSDI的表達(dá)顯著上調(diào)（圖4）。

下丘腦轉(zhuǎn)錄組（圖5 A）和qPCR（圖5 B）結(jié)果顯示，與對(duì)照雌魚(yú)相比，E2注射組雌魚(yú)下丘腦中，生長(zhǎng)相關(guān)基因ghrh、sst1、sst3、sst5和sst6的表達(dá)無(wú)顯著差異（P＞ 0.05）。

圖4 雌魚(yú)下丘腦中類固醇激素合成相關(guān)基因的表達(dá)Fig.4 Steroid genesis related genes expression in hypothalamus of female fish

圖5 雌魚(yú)下丘腦中類固醇激素合成相關(guān)基因的表達(dá)Fig.5 Steroid genesis related genes expression in hypothalamus of female fish

3 討論

雌激素在魚(yú)類、兩棲類、爬行類等低等脊椎動(dòng)物的性別決定、性別分化過(guò)程中具有重要作用，同時(shí)也參與脊椎動(dòng)物卵泡發(fā)育過(guò)程。此外，在生殖軸（下丘腦―垂體―性腺軸）中，雌激素通過(guò)反饋?zhàn)饔谜{(diào)節(jié)下丘腦的生理機(jī)能。在本研究中，E2在體注射雌性金錢魚(yú)后，通過(guò)下丘腦轉(zhuǎn)錄組篩選到22個(gè)差異基因，包括prl、erf3α、pgr和cyp19a1b等11個(gè)表達(dá)上調(diào)基因和chsy1、muc17l、prf1和hla-α等11個(gè)表達(dá)下調(diào)基因，共涉及孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、類固醇激素生物合成、單純皰疹感染、細(xì)胞黏附分子和嘌呤代謝等13個(gè)信號(hào)通路。

3.1 E2在體注射后對(duì)下丘腦中生殖相關(guān)基因表達(dá)的影響

在本研究篩選與鑒定的22個(gè)差異基因中，篩選到3個(gè)生殖相關(guān)信號(hào)通路基因：孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和卵泡成熟通路（pgr）、類固醇激素生物合成通路（cyp19a1b、3β-HSDI）。其中，孕激素受體Pgr介導(dǎo)孕激素在卵泡成熟和排卵過(guò)程中發(fā)揮重要功能，其表達(dá)主要受特異配體孕激素的調(diào)控。本研究qPCR和轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明，在魚(yú)體注射E2能顯著上調(diào)雌魚(yú)下丘腦中pgrmRNA的表達(dá)。在金頭鯛（Sparus aurata）中，研究發(fā)現(xiàn)E2能顯著上調(diào)pgr的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[21-22]。因此，雌激素E2也可通過(guò)反饋?zhàn)饔眉せ钕虑鹉X-垂體中pgr的表達(dá)。此外，本研究中E2在魚(yú)體注射后，腦型芳香化酶基因cyp19a1b在下丘腦中的表達(dá)顯著上調(diào)。同樣，在其他硬骨魚(yú)類中，研究發(fā)現(xiàn)E2能顯著上調(diào)cyp19a1b的表達(dá)[23-26]，其通過(guò)雌激素受體結(jié)合在cyp19a1b基因啟動(dòng)子的雌激素效應(yīng)元件（estrogen response element，ERE）來(lái)激活cyp19a1b的轉(zhuǎn)錄[27-30]。同時(shí)，E2在魚(yú)體注射后，下丘腦中性類固醇激素合成通路關(guān)鍵酶基因3β-HSDI的表達(dá)顯著上調(diào)。這些結(jié)果表明，E2可通過(guò)反饋?zhàn)饔谜{(diào)節(jié)下丘腦中生殖相關(guān)基因的表達(dá)。

3.2 E2在體注射后對(duì)下丘腦中生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)的影響

性類固醇激素，尤其是雌激素參與調(diào)控生長(zhǎng)激素（GH）的分泌和合成。在金錢魚(yú)中，前人研究發(fā)現(xiàn)，E2在魚(yú)體注射6 h后，雌魚(yú)垂體中生長(zhǎng)激素ghmRNA的表達(dá)顯著上調(diào)，肝臟中g(shù)hr1和igf1mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)，而下丘腦中g(shù)hrh表達(dá)未受影響[14-15,31]。垂體中生長(zhǎng)激素gh的表達(dá)受到下丘腦中生長(zhǎng)激素釋放激素Ghrh和生長(zhǎng)抑素Ss的調(diào)控。本研究中轉(zhuǎn)錄組和qPCR結(jié)果顯示，E2在魚(yú)體注射6 h后，下丘腦中生長(zhǎng)激素釋放激素ghrh和生長(zhǎng)抑素sst1、sst3、sst5和sst6mRNA表達(dá)未受到影響。這表明E2可能在垂體和肝臟水平直接或間接地調(diào)控垂體中g(shù)h的表達(dá)，而非通過(guò)下丘腦水平。小鼠垂體細(xì)胞系GH3和MtT/S中的研究發(fā)現(xiàn)，雌激素能顯著上調(diào)細(xì)胞系中GHmRNA的表達(dá)。同樣，在雌激素受體ERα敲除小鼠中，垂體中GHmRNA表達(dá)水平顯著降低，通過(guò)施加E2顯著上調(diào)了GH的表達(dá)，這表明，E2可直接調(diào)控垂體中GH的表達(dá)和GH分泌[32]。此外，E2通過(guò)下調(diào)小鼠肝臟中GHR的表達(dá)減弱肝臟對(duì)生長(zhǎng)激素的敏感度，從而下調(diào)肝臟中IGF1的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)IGF1的負(fù)反饋?zhàn)饔瞄g接上調(diào)垂體中GH的表達(dá)[10,33]。因此，E2還可在肝臟水平間接調(diào)控垂體中GH合成。在金錢魚(yú)中，E2在魚(yú)體注射6 h后，雌、雄魚(yú)垂體中生長(zhǎng)激素ghmRNA的表達(dá)顯著上調(diào)，而肝臟中g(shù)hr1和igf1 mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)[15,31]。在歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）、尼羅羅非魚(yú)、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、馬蘇大馬哈魚(yú)（Oncorhynchus masou）和黑頭軟口鰷（Pimephales promelas）中，高濃度雌激素E2或 EE2處理顯著上調(diào)垂體中g(shù)hmRNA表 達(dá)[34-37]，而肝臟中g(shù)hr1、ghr2和igf1mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)[11,38]。因此，和哺乳類一樣，一方面，雌激素可在直接在垂體水平調(diào)控魚(yú)類gh的表達(dá)；另一方面，雌激素通過(guò)降低肝臟中生長(zhǎng)激素受體ghr表達(dá)降低其對(duì)GH的敏感度，同時(shí)下調(diào)肝臟中胰島素生長(zhǎng)因子igf1的表達(dá)，通過(guò)其負(fù)反饋?zhàn)饔瞄g接調(diào)控垂體中g(shù)h的表達(dá)。

4 結(jié)論

E2注射后激活了金錢魚(yú)下丘腦中生殖通路基因如pgr、cyp19a1b和3β-HSDI的表達(dá)，但下丘腦中生長(zhǎng)軸相關(guān)基因生長(zhǎng)激素釋放激素基因ghrh和生長(zhǎng)抑素基因sst表達(dá)未受到影響。E2主要通過(guò)在垂體和肝臟水平調(diào)節(jié)gh的表達(dá)，而非下丘腦水平。這對(duì)雌激素調(diào)控金錢魚(yú)垂體gh二態(tài)性表達(dá)的分子機(jī)制研究具有重要的參考價(jià)值。