魏雯璐，劉 琪，張丞澍，郝瑞娟，廖永山，王慶恒,,3，鄧岳文,,3

（1.廣東海洋大學水產(chǎn)學院，廣東 湛江 524088；2.南方海洋科學與工程廣東省實驗室（湛江），廣東 湛江 524000；3.廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088；4.廣東海洋大學珍珠研究所，廣東 湛江 524025）

干露脅迫是潮間帶生物經(jīng)常面臨的環(huán)境應(yīng)激因素之一，盡管經(jīng)歷長期選擇進化后，生活在潮間帶的雙殼貝類有一定干露耐受能力，但不同物種或群體之間干露耐受能力仍存在較大差異。前人研究表明，耐干露能力強的群體在生長發(fā)育[1]、存活 率[1-3]和應(yīng)激免疫[4-5]等方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。如肖友翔等[2]指出，較大規(guī)格日本神海蛤稚貝（Panopea japonica）干露后存活率顯著高于較小規(guī)格；于瑞海等[6]對不同生長階段海灣扇貝（Argopecten irradians）干露實驗也表明，成熟成貝對干露更為耐受，存活率高于對干露敏感的稚貝；Meng等[5]報道，經(jīng)同時間干露后，對干露脅迫更為敏感的潮下帶長牡蠣（Crassostrea gigas）存活率低于潮間帶長牡蠣，且有較強代謝抑制，更早發(fā)生糖酵解代謝。可見，干露耐受能力可作為貝類重要的抗逆指標之一，應(yīng)用于生產(chǎn)實踐，在一定程度上提高生產(chǎn)性能。

馬氏珠母貝（Pinctada fucata martensii），又名合浦珠母貝，是我國海水養(yǎng)殖珍珠生產(chǎn)的主要貝種之一[7-8]，為附著性生活，運動能力差。在馬氏珠母貝養(yǎng)殖過程中，體表常常附著大量污損生物和浮泥等，需要定期清理貝體體表的各類附著物，同時使貝體處于干露狀態(tài)，從而引起貝體的應(yīng)激反應(yīng)。另外，在馬氏珠母貝的植核手術(shù)和運輸過程中，亦處于干露狀態(tài)。廣東海洋大學珍珠團隊課題組在長期生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn)，干露耐受能力強的珍珠貝植核后的存活率高于對干露敏感的珍珠貝。本研究利用馬氏珠母貝黑殼色系構(gòu)建干露敏感組及耐受組，分析兩組的免疫基因表達差異及植核后休養(yǎng)期的存活率，探討不同溫度下馬氏珠母貝的干露脅迫耐受能力，為馬氏珠母貝的健康養(yǎng)殖和遺傳育種提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用貝為養(yǎng)殖于廣東省雷州市后洪村海域的馬氏珠母貝黑殼色系，選取鱗片生長旺盛、閉殼有力的成貝用于實驗。馬氏珠母貝室內(nèi)暫養(yǎng)期間，每日投喂3次足量擬微綠球藻（Nannochloropsissp.），海水鹽度為30，溶解氧大于5.0 mg/L。

1.2 實驗設(shè)計與方法

1.2.1實驗I：不同溫度下馬氏珠母貝的干露耐受能力 取2 400只馬氏珠母貝，殼長為（53.75 ± 3.95）mm，清除體表附著物，在室內(nèi)水泥池暫養(yǎng)3 d后，隨機分為4個實驗組，通過恒溫器分別在（22 ± 1）、（26 ± 1）、（30 ± 1）和（34 ± 1）℃下進行干露脅迫。每個實驗組設(shè)3個平行，每個平行200只貝。以雙殼張開持續(xù)15 s為開口標準，以觸碰外套膜后貝體反應(yīng)遲緩不能完全閉殼為瀕死標準，記錄實驗貝的開口及瀕死情況。

1.2.2實驗II：干露敏感組與耐受組免疫指標比較 取2 000只成貝（規(guī)格及暫養(yǎng)處理同實驗I），在22 ℃下進行干露，發(fā)現(xiàn)貝開口后及時放回海水養(yǎng)殖池中進行恢復(fù)，以選擇強度8%將最先開口的160只貝作為干露敏感組（S組）；第1 840只開口后，剩余的160只為干露耐受組（T組），并將兩組馬氏珠母貝在水泥池中暫養(yǎng)7 d以恢復(fù)體質(zhì)。暫養(yǎng)結(jié)束后，將S組和T組在22 ℃下再次干露脅迫，分別在干露前（0 h）、干露處理2 h和干露處理14 h的時候從S組和T組各隨機剪取25個個體的鰓，經(jīng)液氮速凍，用于提取總RNA，利用等量混合原則將每組25個個體的總RNA每5個混為一個樣品用于后續(xù)實驗。2 h和14 h分別是實驗II獲得的S組大量開口和瀕死時間點。

將鰓組織樣品利用Trizol法提取總RNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，Nano Drop ND 1000紫外分光光度計（Thermo公司）檢測RNA的純度及濃度。cDNA第一鏈的合成參照M-MLV 試劑盒說明書（TaKaRa公司）進行。

在馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上，用Primer Premier 5.0 軟件，設(shè)計本實驗所需引物（表1），檢測脯氨酸羥化酶（PHD）、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（GLUT）、髓樣分化因子（MYD88）、熱休克蛋白（Hsp70、Hsp20）和凋亡抑制因子（cIAP）基因的表達水平。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

相關(guān)基因表達采用qRT-PCR檢測，qRT-PCR反應(yīng)體系為0.4 μL cDNA，0.4 μL上游引物和0.4 μL下游引物和5 μL SYBR，總體積10 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。通過觀察每個反應(yīng)后的解鏈曲線確認 PCR 產(chǎn)物的特異性。以 β-肌動蛋白為內(nèi)參照建立各基因的標準曲線，驗證基因表達的線性。使用delta CT 法[2Δ(Cтβ-actin-Cт目的基因)]計算相關(guān)基因在兩組不同時間點的表達量，利用SPSS軟件對相對表達量均值做顯著性差異分析，顯著性水平設(shè)定為α=0.05。

1.2.3實驗III：干露敏感組與耐受組植核后休養(yǎng)期的存活率比較 2019年10月（秋季）和2020年4月（春季），分別取5 000只黑殼色系馬氏珠母貝，秋季插核貝殼長為（61.54 ± 3.28）mm，春季插核貝殼長為（62.17 ± 4.05）mm，在室溫下（約26 ℃）進行干露，以選擇強度8%將最先開口的400只貝作為干露敏感組；第4 600只開口后，剩余的400只為干露耐受組，將兩組珍珠貝轉(zhuǎn)移到徐聞大井村海區(qū)暫養(yǎng)7 d后，剔除每組死亡個體，隨機選擇200只貝，由同一組技術(shù)員按照常規(guī)育珠技術(shù)插核，在海區(qū)養(yǎng)殖30 d后統(tǒng)計存活率。利用SPSS 19.0比較組間存活率差異，顯著性水平設(shè)定為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 溫度對馬氏珠母貝干露耐受能力的影響

分別在22、26、30和34 ℃下進行干露脅迫，記錄各組馬氏珠母貝的時間—開口率的變化，如圖1所示。4 h時，34 ℃組馬氏珠母貝的開口率已達（82.36 ± 1.47）%，22、26和30 ℃組均低于45%，依次為（17.68 ± 0.97）%、（23.28 ± 1.98）%和（33.72 ± 6.04）%；12 h時，34 ℃組馬氏珠母貝全部開口，26 ℃和30 ℃組也高達90%以上，分別為（93.80 ±2.27）%和（97.36 ± 1.84）%，然而22 ℃組的開口率僅為（52.39 ± 7.08）%；當干露時長達28 h時，22 ℃組才全部開口。

圖1 不同溫度干露脅迫下馬氏珠母貝開口率的變化Fig.1 Changes of periodic opening rate under air exposure stress in experimental groups at different temperatures

如圖2所示。12 h時，34 ℃組馬氏珠母貝的累計瀕死率為（51.01 ± 5.60）%，其余各組均低于15%，依次為（6.15 ± 1.66）%、（3.26 ± 0.25）%和（9.23 ± 1.66）%；20 h時，34 ℃組馬氏珠母貝的累計瀕死率為100%，30 ℃組也高達（84.90 ± 4.91）%，然而22 ℃和26 ℃組均低于30%，分別為（23.44 ± 5.29）%和（14.51 ± 7.24）%；44 h以后，22 ℃和26 ℃組的累計瀕死率接近100%。

圖2 不同溫度干露脅迫下馬氏珠母貝累積瀕死率的變化Fig.2 Changes of cumulative near-death rate under air exposure stress in experimental groups at different temperatures

2.2 干露敏感組（S）與耐受組（T）免疫指標比較

2.2.1脯氨酸羥化酶（PHD）、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（GLUT）表達差異 圖3可知，兩組PHD和GLUT表達總體呈上升趨勢，而T組在2 hPHD表達量較0 h有一定下降，之后上升。且在0、2和14 h時，S組PHD和GLUT表達量高于T組；在14 h時，其中S組PHD和GLUT表達量顯著升高于0、2 h時（P＜ 0.05），且14 h時顯著高于T組（P＜ 0.05）。

圖3 S組及T組不同時間點PHD、GLUT表達量的變化Fig.3 Changes of PHDand GLUT expression in S and T groups at different time points

2.2.2髓樣分化因子（MYD88）表達差異 由圖4可知，隨著干露時間延長，兩組MYD88的表達量均表現(xiàn)上升趨勢，S組的表達量在2 h和14 h顯著升高（P＜ 0.05），T組在14 hMYD88表達量較其在0、2 h顯著上升（P＜ 0.05）。

圖4 S組及T組不同時間點MYD88表達量的變化Fig.4 Expression levels of MYD88 in S and T groups at different time points

2.2.3熱休克蛋白（Hsp70和Hsp20）表達差異 圖5可知，Hsp70和Hsp20表達隨干露時間延長呈相同變化趨勢，表現(xiàn)為上升趨勢，且兩組均在14 h相較于各組0、2 h時顯著上升（P＜ 0.05），且T組Hsp20表達量在14 h時顯著高于S組（P＜ 0.05）。

2.2.4凋亡抑制因子（cIAP）表達差異 圖6可知，兩組cIAP表達隨干露時間延長呈現(xiàn)相同上升趨勢，且在不同時間點S組表達量均高于T組，兩組在14 h相較于各組的0、2 h表達顯著上升（P＜ 0.05）。

2.3 干露育珠貝休養(yǎng)期存活率的影響

由表2可知，干露耐受組在春、秋季植核后珠休養(yǎng)期存活率均顯著高于干露敏感組（P＜ 0.05）。

圖5 S組及T組不同時間點Hsp70、Hsp20表達量的變化Fig.5 The expression levels of Hsp70 and Hsp20 in Groups S and T at different time points

圖6 S組及T組不同時間點cIAP表達量Fig.6 Expression levels of cIAP in Groups S and T at different time points

表2 干露對育珠貝休養(yǎng)期存活率的影響Table 2 Influence of exposed to air on survival during resting period of Pinctada fucata martensii%

3 討論

溫度是制約雙殼貝類生長發(fā)育和干露耐受能力的主要因素之一，已有研究表明，夏季高溫雙殼貝類的死亡率顯著升高[9]。干露時長也影響著雙殼貝類的干露耐受能力，如對西施舌稚貝的研究[10]表明，短時間的干露對西施舌稚貝生長無不利影響，但時間過長則會導(dǎo)致死亡，且隨溫度提高死亡時間顯著提前；劉毅等[11]對黑足鮑研究表明，黑足鮑的干露耐受能力隨著溫度升高而降低，隨著干露時間的延長，黑足鮑代謝系統(tǒng)和免疫相關(guān)功能紊亂，嚴重影響其生存；孫遺陽等[12]對厚殼貽貝稚貝的研究表明，厚殼貽貝稚貝干露后存活率與干露時間呈顯著負相關(guān)（P＜ 0.05），且低溫時干露耐受能力是高溫時的3倍以上；王文文[13]的研究表明蛤仔在25 ℃以下，干露48 h內(nèi)存活率高于90%。本研究表明，不同溫度下干露脅迫對馬氏珠母貝影響較大，高溫條件下貝體對干露耐受能力低，而在適宜溫度下，貝體對干露的耐受力強，且干露耐受力隨干露時間延長而下降，與上述學者研究結(jié)果一致。

生物系統(tǒng)密切監(jiān)視環(huán)境條件的急性變化，啟動調(diào)節(jié)反應(yīng)，并使用負反饋回路來限制這些反應(yīng)的程度。為適應(yīng)慢性變化，許多環(huán)境傳感器都能夠調(diào)整其閾值，從而可以對現(xiàn)在不同的設(shè)定點的急劇偏差做出響應(yīng)。細胞的一組酶直接控制由去穩(wěn)定低氧誘導(dǎo)因子（HIF），以降低氧的細胞應(yīng)答感測環(huán)境氧[14]。這些氧氣感應(yīng)酶包括脯氨酸-羥化酶（PHD），PHD是脯氨酸羥基化酶-低氧誘導(dǎo)因子氧感受體系相關(guān)基因[15]。在生物受到低氧脅迫時，PHD會根據(jù)氧濃度的變化迅速調(diào)控羥基化活性，啟動低氧響應(yīng)從而激活下游轉(zhuǎn)錄因子，包括糖酵解的相關(guān)基因[16-17]，如葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（GLUT）。PHD在S組中的表達量都隨著干露時間的延長而不同程度增加，在S組瀕死的時候PHD的表達量顯著增加，這可能意味著S組在干露應(yīng)激情況下，此時機體內(nèi)對氧氣的調(diào)節(jié)已經(jīng)出現(xiàn)較大紊亂，從而顯著上調(diào)其表達以代償，而T組則在干露下，PHD的表達量較為穩(wěn)定增加，在此期間，T組可能在干露應(yīng)激下，做出防御反應(yīng)的同時也在調(diào)整著自身的氧氣耐受閾值。本研究中，兩組在干露后GLUT表達量均有不同程度增加，這與Yang等[18]研究結(jié)果一致，在缺氧條件下，水生動物會針對減少的O2環(huán)境啟動多種代謝適應(yīng)，將代謝從有氧氧化轉(zhuǎn)換為糖酵解途徑是增加葡萄糖攝取以促進對低O2應(yīng)激反應(yīng)的一種策略[19]。因此，對葡萄糖的更高需求導(dǎo)致細胞膜上葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的數(shù)量增加。在干露期間T組中GLUT表達量低于S組，可見T組中對葡萄糖的攝取需求可能弱于S組，機體還處于穩(wěn)定狀態(tài)，而與有氧代謝相比，厭氧代謝的產(chǎn)能效率更低，更不利于維持機體能量。因此干露T組較低的GLUT表達量可能與其較強的低氧耐受性有關(guān)。

在干露應(yīng)激下，機體細胞表面受到非己信號刺激時會激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因發(fā)揮一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)。MYD88是Toll樣受體（Toll-likereceptor，TLR）信號通路中的一個關(guān)鍵接頭分子[20-21]，MYD88介導(dǎo)的信號通路在無脊椎動物免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[22]。在兩組干露脅迫后都表現(xiàn)出隨時間延長顯著增加的趨勢，然而，T組的MYD88在此過程中表達水平低于S組，這可能表明，在干露狀態(tài)下T組中免疫反應(yīng)弱于S組，這可能是T組對干露不敏感的原因之一，T組通過調(diào)節(jié)自身免疫應(yīng)答反應(yīng)抑制以抵御干露脅迫。

熱激蛋白（HSPs）是機體應(yīng)激相關(guān)的蛋白質(zhì)[23]，HSPs還充當其他蛋白的細胞內(nèi)伴侶，并作為細胞修復(fù)系統(tǒng)的一部分[24]。在缺氧期間，HSPs的產(chǎn)生會應(yīng)壓力而增加[25]，這可能是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)的結(jié)果，并且可能是某些組織中的早期轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的結(jié)果。因此，這些mRNA隨時準備對任何壓力情況做出快速反應(yīng)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)干露脅迫使貝體Hsp70、Hsp20的表達顯著變化，這與Bao等[27]研究結(jié)果一致。兩組Hsp70和Hsp20的表達量都在干露期間有上升趨勢，研究指出，Hsp70分子伴侶蛋白在細胞氧化應(yīng)激過程中蛋白酶體的解離和結(jié)合中有重要介導(dǎo)作用，可降解氧化損傷的蛋白質(zhì)并能承受應(yīng)力暴露的最初影響[28]。而Hsp20蛋白可以在壓力下參與多種細胞過程，包括經(jīng)歷構(gòu)象破壞的底物蛋白的ATP依賴性穩(wěn)定作用或與脂質(zhì)分子結(jié)合以調(diào)節(jié)膜結(jié)構(gòu)的流動性，提示Hsp20可能參與應(yīng)激刺激的感知，從而導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活[29]。本研究發(fā)現(xiàn)在0、2 h兩者的表達量S組都高于T組，對S組來說，氧化應(yīng)激對其造成的影響可能遠超T組，機體在應(yīng)激下大量調(diào)動Hsp70伴侶蛋白來增強自身對細胞的保護力，并上調(diào)Hsp20表達以調(diào)節(jié)膜結(jié)構(gòu)流動性，以維持細胞穩(wěn)定性。而T組在14 hHsp70、Hsp20表達量高于組，S組此時處于瀕死狀態(tài)，機體內(nèi)基因表達處于紊亂狀態(tài)，盡管機體可能還在利用上調(diào)的基因表達來抵抗應(yīng)激，但難以修復(fù)其氧化應(yīng)激造成的嚴重損傷，而此時T組在耐受干露脅迫的情況下，仍能顯著增加其表達，推測T組對氧化應(yīng)激的耐受力強于S組，且機體在降解氧化損傷的蛋白質(zhì)或參與應(yīng)激刺激感知等方面顯示出優(yōu)勢差異有關(guān)。

細胞凋亡是機體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡[30]。凋亡調(diào)控是機體維持平衡穩(wěn)定的前提，而調(diào)控包含促進和抑制凋亡的兩方面作用，其中抑制凋亡的作用由凋亡抑制因子IAP家族蛋白承擔[31]。本研究發(fā)現(xiàn)cIAP在S組各個時間點表達量都高于T組，這表明，S組機體在面對干露脅迫時，大量表達cIAP使機體抗凋亡作用更顯著。凋亡抑制蛋白雖然可以抑制細胞內(nèi)的caspases活性，阻止凋亡的進行，但細胞發(fā)生了嚴重損傷，如線粒體的不可逆性變化，導(dǎo)致ATP 生產(chǎn)的缺乏時，細胞將進入不可逆的凋亡反應(yīng)。因此IAP 阻斷細胞凋亡的調(diào)控受多種因素影響，它不僅依賴于刺激的種類，而且還和刺激的強度有關(guān)[32]。但是在2 h時間點，cIAP發(fā)生較大變化，這可能是S組進入瀕死狀態(tài)且細胞發(fā)生嚴重不可逆的損傷有關(guān)。因此可見，抗凋亡對機體和單個細胞不同干露時間的意義并不相同。

馬氏珠母貝是重要的育珠母貝之一，而插核育珠是珍珠養(yǎng)殖的中心環(huán)節(jié)。本研究結(jié)果顯示，在經(jīng)歷干露脅迫后，春季和秋季插核后耐受組休養(yǎng)期存活率均顯著高于敏感組，這表明干露耐受能力的差異可以作為馬氏珠母貝抗逆性的重要且易于利用的指標，應(yīng)用于養(yǎng)殖品種培育工作，同時也驗證了課題組之前的生產(chǎn)實踐經(jīng)驗理論。

在馬氏珠母貝養(yǎng)殖、育珠過程中，經(jīng)常遭受干露脅迫，引起貝體的應(yīng)激反應(yīng)，嚴重時影響其生存，極大地制約了馬氏珠母貝的養(yǎng)殖與育珠，而干露耐受能力強的個體顯現(xiàn)出優(yōu)于敏感個體的表型特征。本研究首先分析在不同溫度下干露脅迫對馬氏珠母貝的影響，并在適溫條件下獲得干露敏感組和干露耐受組，分析比較兩組馬氏珠母貝的免疫基因表達量和植核后休養(yǎng)期的存活率，探究干露敏感組和干露耐受組的差異，為馬氏珠母貝健康養(yǎng)殖和選育耐干露品種提供理論指導(dǎo)。