（江蘇科技大學生物技術(shù)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212018）

小球藻 (Chlorellasp.) 是一種單細胞綠藻，細胞直徑3～8 μm，有光合效率高、生長速率快等特點[1]，且富含蛋白質(zhì)、多糖、脂肪酸、色素和維生素等營養(yǎng)成分，在食品、飼料、化工、能源等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景[2]。此外，小球藻有降血糖、血壓、血脂等功效，對預防和治療心腦血管疾病有較好效果，甚至可抑制腫瘤細胞的生長[3]。但由于其個體微小、培養(yǎng)濃度低等原因，采收工藝和成本一直是困擾其規(guī)模化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)問題之一。有數(shù)據(jù)顯示，小球藻的采收成本占其生產(chǎn)成本的20%～30%[4]。因此，探索一種效率高、成本低、操作簡單的采收工藝是當前小球藻規(guī)模化生產(chǎn)過程中亟需解決的問題。

目前，小球藻的采收方法主要有離心分離法、過濾分離法和化學絮凝法等[5-6]。離心分離法是規(guī)模化采收小球藻時普遍使用的方法，但此法設(shè)備投資大、能耗高，離心力較大時會破壞藻細胞，影響其生理活性[7]。過濾分離法采收效率易受濾膜孔徑影響，且存在濾膜清洗更換費用高、易污染等問題[8-9]。化學絮凝法有效率高、成本低、易控制、操作簡單等特點，已廣泛應(yīng)用于微藻采收。絮凝劑是采收效果的決定因素。常用于采收微藻的絮凝劑有FeCl3、石灰和明礬，以FeCl3最為常用。三氯化鐵對球等鞭金藻 (Isochrysis galbana) 采收效率超90%[10]，對三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutumBohlin）的采收效率超過95%[11]。目前關(guān)于三氯化鐵對小球藻的絮凝采收已有報道。劉國記[12]和左志鵬等[13]研究了不同濃度的FeCl3對小球藻絮凝效率的影響；張文君[14]研究了絮凝時間和FeCl3用量對小球藻絮凝效果的影響；趙奎等[15]研究了氯化鐵等8種不同的化學絮凝劑對小球藻絮凝效果的影響。這些研究均考察單因素對采收效果的影響，缺乏多因素綜合影響采收效果的研究，關(guān)于三氯化鐵對小球藻的絮凝采收效果和工藝條件還有待進一步研究。本研究在分析三氯化鐵濃度、小球藻初始濃度、絮凝時間等工藝參數(shù)對小球藻采收效率影響的基礎(chǔ)上，進一步通過響應(yīng)面法優(yōu)化三氯化鐵絮凝采收小球藻的工藝條件，為規(guī)模化采收小球藻提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 六水合氯化鐵 (FeCl3·6H2O) 購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2藻種 小球藻 (Chlorella sorokiniana,FACHB-275) 購自中國科學院淡水藻種庫。在無菌條件下，將小球藻轉(zhuǎn)接到BG11培養(yǎng)基中進行同步化培養(yǎng)，至對數(shù)生長期后再進一步擴大培養(yǎng) （培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，照度3 000 lx，光暗周期為12 h L:12 h D）。步驟為：先確定小球藻的濃度，將小球藻質(zhì)量濃度調(diào)至0.20 g/L左右，置于智能光照培養(yǎng)箱 (GXZ型，多段編程，寧波江南儀器廠) 中通氣培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，照度3 000 lx，光/暗周期為12 h L/12 h D,CO2體積分數(shù)為1.0%。繪制小球藻生長曲線，判定其生長前期、指數(shù)生長期、穩(wěn)定期和凋亡期等生長階段。

1.2 單因素實驗

1）設(shè)置絮凝時間為30 min，小球藻初始質(zhì)量濃度為0.42 g/L，F(xiàn)eCl3質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 g/L；2）設(shè)置FeCl3質(zhì)量濃度為0.6 g/L，小球藻初始質(zhì)量濃度為0.42 g/L，絮凝時間分別為0、5、10、15、20、30、40、60和120 min；3）設(shè)置FeCl3質(zhì)量濃度為0.6 g/L，絮凝時間為30 min，小球藻初始質(zhì)量濃度分別為0.14、0.28、0.42、0.55和0.69 g/L。分析FeCl3濃度、絮凝時間和小球藻初始濃度對采收效率的影響。

1.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，利用Design-Expert軟件的Box-Behnken模型設(shè)計實驗進行響應(yīng)面分析，優(yōu)化影響采收小球藻效率的3個工藝參數(shù)，即絮凝劑質(zhì)量濃度（X1）、絮凝時間（X2）、藻液初始質(zhì)量濃度（X3）（表1）。

表1 用FeCl3采收小球藻工藝的因素水平Table 1 Factors and levels of harvesting technology for Chlorella sorokiniana using FeCl3

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行回歸分析，從而得到這3個因素一次效應(yīng)、二次效應(yīng)、交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程，以此為參照，對采收小球藻的工藝條件進行優(yōu)化。

1.4 采收效率測定

在680 nm波長下，小球藻藻液具有最大吸收波長。用紫外可見分光光度計 (UV-1800PC型，上海美譜達儀器有限公司) 測定小球藻藻液在680 nm波長下的光密度值(x)，其值與其細胞濃度成線性關(guān)系[16]，并以此確定小球藻生物量 (y)。

其中，X0表示小球藻的初始質(zhì)量濃度，Xt表示絮凝時間為t時小球藻的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 FeCl3濃度、絮凝時間和初始濃度對小球藻采收效率的影響

圖1_a表明，當FeCl3質(zhì)量濃度小于0.6 g/L時，小球藻采收效率隨FeCl3質(zhì)量濃度的增加而增大，最大采收效率為90.17%。這是因為Fe3+可通過中和藻細胞表面的負電荷，降低藻細胞之間的靜電斥力，使其形成聚集體，可見Fe3+濃度越高越有利于藻細胞的沉降；此外，F(xiàn)e3+還可在一定條件下形成難溶性鹽，以網(wǎng)捕沉淀和吸附架橋等方式作用于藻細胞，進一步促進藻細胞的沉降[18]。因此，隨著FeCl3濃度的增加，藻細胞與絮凝劑之間的接觸機率增大，從而使小球藻的采收效率增加。但隨FeCl3質(zhì)量濃度的繼續(xù)升高（大于0.6 g/L時），小球藻采收效率開始下降，這可能是因為FeCl3過多時，不僅破壞藻細胞，還會引入大量正電荷，過量的正電荷在系統(tǒng)中相互排斥，從而使采收效果減弱，如當FeCl3質(zhì)量濃度大于1.6 g/L時，采收效率顯著降低，與以FeCl3為絮凝劑分別采收凱氏擬小球藻(Parachlorella kessleri）和普通小球藻(Chlorella vulgaris）的結(jié)果[12,14]相近。

圖1 FeCl3濃度、絮凝時間和初始濃度對利用FeCl3采收小球藻效率的影響Fig.1 Effects of FeCl3 concentrations,flocculation time,and initial concentrations on the harvesting efficiency of Chlorella sorokiniana using FeCl3

由圖1_b可知，當FeCl3質(zhì)量濃度為0.6 g/L、藻液初始質(zhì)量濃度為0.42 g/L時，小球藻采收效率隨絮凝時間的增加而顯著上升，在絮凝30 min后達到較高水平，而當絮凝時間大于30 min時，采收效率基本穩(wěn)定，與張文君[14]以FeCl3為絮凝劑采收普通小球藻的結(jié)果相近。這是因為絮凝時間越長，藻細胞與絮凝劑之間以及與藻細胞之間接觸越緊密，相互結(jié)合并沉降，因而采收率較高。但一定時間后，采收率基本穩(wěn)定，繼續(xù)增加絮凝時間采收率變化不大。主要原因可能是小球藻表面的陰離子與絮凝劑FeCl3中的Fe3+的結(jié)合已達到飽和狀態(tài)，繼續(xù)增加絮凝時間并不會增加小球藻的采收率。趙奎等[15]在研究利用FeCl3采收埃氏小球藻(Chlorella emersonii)的過程中發(fā)現(xiàn)，絮凝效率隨絮凝時間的增加而增大，達到最大值后，隨著絮凝時間的延長，采收率變化不大；左志鵬等[13]研究表明，當FeCl3質(zhì)量濃度為0.6 g/L時，絮凝時間為30 min，小球藻細胞采收率最大，與本研究結(jié)果相近。

由圖1_c可知，在FeCl3質(zhì)量濃度為0.6 g/L，絮凝時間為30 min條件下，小球藻初始質(zhì)量濃度在0.14～0.42 g/L時，小球藻采收效率隨其初始質(zhì)量濃度的升高而增大，0.42 g/L時采收效率達最大值（90.06±0.29）%。而當小球藻初始濃度繼續(xù)升高時，采收效率開始下降。這與張海陽等[19]結(jié)果基本一致，他們認為藻液濃度越大，采收效果越好，但當藻細胞濃度過大時，藻細胞所帶負電荷多于絮凝劑電離產(chǎn)生的正電荷，過多的負電荷相互排斥，又導致采收率下降[20]。

2.2 利用響應(yīng)面法進行采收條件優(yōu)化

2.2.1Box-Behnken中心組合優(yōu)化 為優(yōu)化采收工藝參數(shù)，共設(shè)計17個實驗點，其中有12個是析因?qū)嶒?，另?個為中心實驗，析因?qū)嶒烖c自變量選擇X1、X2、X3構(gòu)成的三維頂點，其中零點區(qū)域為中心點，并在該區(qū)域重復5次 (表2)，以此估計實驗誤差[21]。

表2 采收工藝的響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface tests for the harvesting technology

2.2.2回歸方程的建立與檢驗 用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表2數(shù)據(jù)進行回歸分析，可得FeCl3濃度（X1）、絮凝時間（X3）和小球藻初始濃度（X2）對小球藻采收效率 (Y) 影響的二次多項回歸方程：

根據(jù)該二次多項回歸方程的方差分析和顯著性檢驗結(jié)果 (表3)，此回歸模型較為顯著 (P=0.0246 ＜ 0.05)，失擬項不顯著 (P=0.0533 ＞ 0.05)，且校正的R2=0.861 8，精確度（Adeq Precisior,AP）為7.578 ＞ 4?？梢?，此回歸方程的擬合度和可信度均達較高水平。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果可知，方程一次項X2對小球藻采收效率的線性效應(yīng)較為顯著，但X1和X3對小球藻采收效率的線性影響則較不顯著，各因素一次項對小球藻采收效率的影響順序依次為X2＞X1＞X3；交互作用項中X1X2對小球藻的采收效率有較顯著影響；二次項中X12對小球藻的采收效率有極顯著影響，其余項對小球藻采收效率的影響均不顯著。因此，在利用FeCl3采收小球藻時，小球藻初始濃度對小球藻采收率的影響最顯著，所以首先需調(diào)節(jié)小球藻的初始濃度；考慮到3個因素間交互作用中，F(xiàn)eCl3濃度和小球藻初始濃度間的交互作用對采收率的影響最顯著，因此，合理控制這兩者的交互作用，亦可提高小球藻的采收率。此外，對FeCl3采收小球藻的各項條件進行優(yōu)化后，獲得的最大采收效率比馬志欣等[22]利用聚合氯化鋁采收普通小球藻時獲得的最大采收效率高2.75%，說明FeCl3是適合采收小球藻的一種無機絮凝劑，可在規(guī)?；墒招∏蛟鍟r推廣應(yīng)用。

表3 小球藻采收工藝條件優(yōu)化的回歸方程方差分析及其系數(shù)顯著性檢驗Table 3 Variance analysis of regression equation and significance test of coefficient for optimizing harvesting conditions of Chlorella sorokiniana using FeCl3

2.2.3小球藻采收因素間的交互作用分析 利用Design-Expert 8.0.6.1軟件，根據(jù)回歸方程繪制圖像進行分析，得到響應(yīng)面圖（圖2）。圖2_a可見，當絮凝時間為45 min時，F(xiàn)eCl3濃度和小球藻初始濃度的交互作用對小球藻采收效率的影響為顯著水平，當絮凝時間一定時，隨著FeCl3濃度的增加采收效率先升高后下降，同樣，隨著小球藻初始濃度的增加，采收效率亦先升后降，即當FeCl3濃度處于中水平，小球藻初始濃度也處于中水平時，小球藻的采收效率處于高水平。由圖2_b可知，當小球藻初始質(zhì)量濃度為0.42 g/L時，F(xiàn)eCl3濃度和絮凝時間的交互作用對小球藻采收效率的影響不顯著，即當小球藻初始濃度一定時，隨著FeCl3濃度的增加采收效率先升高后下降，而隨著絮凝時間的增加，采收效率是逐漸上升的，并且緩慢達到一個較高水平，即當FeCl3濃度處于中水平，絮凝時間處于高水平時，小球藻的采收效率處于較高水平。圖2_c顯示，當FeCl3質(zhì)量濃度為0.6 g/L時，小球藻初始濃度和絮凝時間的交互作用對小球藻采收效率的影響不顯著，即當FeCl3濃度一定時，隨著小球藻初始濃度的增加，采收效率先快速升高后略有下降，并在初始質(zhì)量濃度為0.42 g/L時采收效率達到較高水平，另外隨著絮凝時間的增加，采收效率亦逐漸上升，最后達到一個較高水平，即當小球藻初始濃度處于較高水平，絮凝時間處于高水平時，小球藻的采收效率處于較高水平。

2.2.4最優(yōu)工藝參數(shù)的確定 根據(jù)上述Box-Behnken模型給出的數(shù)據(jù)和圖像分析可得出，利用FeCl3采收小球藻的最優(yōu)工藝參數(shù)，分別為FeCl3質(zhì)量濃度為0.64 g/L，小球藻初始質(zhì)量濃度為0.55 g/L，絮凝時間為38.01 min，在此工藝條件下，所得小球藻采收效率的理論值為96.72%?？紤]到實際操作情況，將FeCl3采收小球藻的最佳工藝條件修正為FeCl3質(zhì)量濃度為0.6 g/L，小球藻初始質(zhì)量濃度為0.55 g/L，絮凝時間為38 min，以檢測響應(yīng)面法所預測的最優(yōu)工藝的可靠性。通過檢驗，實際測得小球藻在此工藝條件下的采收效率達到 (98.57±1.85)%，這與采收效率理論預測值的誤差為1.91% (＜ 5%)，表明通過響應(yīng)面法實驗得到的最優(yōu)采收工藝參數(shù)切實可行。此外，通過響應(yīng)面法對小球藻采收條件進行優(yōu)化后，找到既節(jié)省成本和時間，小球藻采收效率又高的最佳工藝條件，比薛蓉等[23]未優(yōu)化采收條件的采收效率高6.3%。

圖2 小球藻初始濃度與FeCl3濃度 (a)、絮凝時間與FeCl3濃度 (b)、絮凝時間與初始濃度 (c) 的交互作用對采收效率的影響Fig.2 Interaction effects of initial concentrations and FeCl3 concentrations (a),flocculation time and concentrations of FeCl3 (b),and flocculation time and initial concentrations (c) on the harvesting efficiency of Chlorella sorokiniana using FeCl3

3 結(jié)論

本研究通過單因素實驗研究FeCl3濃度、絮凝時間、小球藻初始濃度等3個因素對小球藻采收效率的影響，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化利用FeCl3采收小球藻的工藝參數(shù)，可獲得如下結(jié)論：

1）利用FeCl3絮凝采收小球藻的最優(yōu)工藝條件為小球藻初始質(zhì)量濃度0.55 g/L，F(xiàn)eCl3質(zhì)量濃度0.6 g/L，絮凝時間38 min，在此條件下，所得小球藻采收效率為 (98.57±1.85)%。

2）影響FeCl3絮凝采收小球藻的各因素一次項順序為小球藻初始濃度 ＞ FeCl3濃度 ＞ 絮凝時間。