孫雯雯 吳開祥 李小龍 張 亞 東野圣伊 黃 虎 丁寶琪 楊洪川 王新立

山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，山東 泰安 271000

免疫組化檢測技術(shù)在臨床病理診斷工作中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。免疫組化染色技術(shù)因其步驟復(fù)雜，影響因素較多，在免疫組化染色過程中設(shè)立對照成為免疫組化染色質(zhì)控的重要措施[1-4]。隨著免疫組化技術(shù)的不斷發(fā)展，免疫組化對照的設(shè)立涌現(xiàn)出不同的方法。很多方法步驟繁瑣，需要特殊儀器設(shè)備支持，實用性不高。本科室根據(jù)實際臨床工作經(jīng)驗，在遵循國際特殊專家委員會建議及免疫組織化學(xué)檢測技術(shù)共識的基礎(chǔ)上構(gòu)建了免疫組化組織微陣列對照體系，并用簡易方法制作蠟塊及切片，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 組織來源

山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床病理外檢中滿足臨床病理診斷后剩余的常規(guī)新鮮組織。

1.2 儀器設(shè)備

Leica ASP 300自動脫水機、Leica RM2235石蠟切片機、Leica 819一次性病理刀片、Leica EG1150H石蠟包埋機及冷臺、不銹鋼包埋模具、世泰粘附性載玻片。

1.3 組織微陣列體系的構(gòu)建

根據(jù)本實驗室抗體使用頻率、所需對照組織獲取的難易度、抗體在不同組織中表達情況，遵循國際特設(shè)專家委員會推薦18種常見抗體對照組織、免疫組織化學(xué)檢測技術(shù)共識及染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建組織微陣列體系，滿足每種抗體在檢測時具有至少一個的陽性對照，一個陰性對照，并盡可能提供多個陽性、陰性對照組織。

1.4 目的組織篩選

所需組織用10%中性緩沖福爾馬林固定24～48 h，按常規(guī)取材標(biāo)準(zhǔn)取材，全自動脫水機常規(guī)進行脫水、透明、浸蠟，包埋成蠟塊。將蠟塊行HE切片并染色，根據(jù)鏡下觀察選定組織的目的區(qū)域，并作標(biāo)記。目的區(qū)域的選擇應(yīng)首先滿足無鈣化無壞死無異物(如縫合用鋼釘)區(qū)，其次要保證抗體表達的陽性部位存在，如闌尾要有淋巴濾泡及腺體結(jié)構(gòu)，甲狀腺要有正常腺體，結(jié)腸、胃等要保證有腸粘膜、胃粘膜，所選腫瘤組織如乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌等鏡下確保是腫瘤組織。

1.5 組織微陣列蠟塊的制作

用廢舊一次性病理刀片，將組織目的區(qū)域切成約0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm的小組織塊，按照組織微陣列對照體系分組，用尺寸較小的包埋磨具(約0.7 cm×0.7 cm)將目的組織包埋，制成組織微陣列蠟塊并標(biāo)記編號。包埋時要注意組織方向，如闌尾、結(jié)腸、食管等管腔類組織縱切面朝下，并確保全部組織埋平。

1.6 組織微陣列切片的制作

組織微陣列蠟塊冷凍后進行切片，切片厚度2.0～2.5 μm，蠟片貼裱于免疫組化專用粘附性載玻片據(jù)底端0.5 cm處中央，用鉛筆標(biāo)記陽性對照組織微陣列的編號，72 ℃烤片15～30 min，或室溫自然涼片至干燥。室溫保存?zhèn)溆?，隨切隨用，對照片滿足1周使用即可，防止時間過長引起抗原丟失。組織微陣列蠟塊每次切完后放置于-20 ℃冰箱內(nèi)冷藏，隨用隨切，還可保護組織內(nèi)抗原，防止其丟失。

2 結(jié) 果

2.1 構(gòu)建了5個組織微陣列對照體系，編號為1～5。1號包括闌尾、肺、肝癌、胰腺、扁桃體；2號包括子宮內(nèi)膜及肌層、乳腺癌、宮頸癌、食管、結(jié)腸；3號包括網(wǎng)膜、甲狀腺、胎盤、腎、胃；4號包括GIST、腱鞘巨、前列腺癌、P53、睪丸；5號包括表達(0，1+，2+，3+)her-2的乳腺癌組織。5個組織微陣列，分別用于不同抗體的對照使用，可為我科室130多種抗體提供穩(wěn)定可靠的陽、陰性組織對照。具體見表1。

表1 組織微陣列對照體系構(gòu)成

2.2 制作了5種組織微陣列蠟塊，無需特殊儀器設(shè)備，技術(shù)易掌握(圖1)。

2.3 制作了5種組織微陣列切片，方法簡單，組織貼裱于載玻片據(jù)底端0.5 cm處中央，被測試組織貼裱其上方即可，整齊美觀(圖1)。

a：組織微陣列蠟塊；b:檢測組織與微陣列對照組織染色切片；c:組織微陣列免疫組化染色后鏡下表現(xiàn)。

3 討 論

免疫組化染色步驟繁多，任何一步操作不當(dāng)都可能會影響染色結(jié)果，進而影響病理診斷的準(zhǔn)確性。在免疫組化染色過程中設(shè)立對照是進行染色質(zhì)量控制的重要措施之一，通過陽性對照、陰性對照的染色結(jié)果可驗證免疫組化操作步驟是否正確、染色結(jié)果是否準(zhǔn)確及染色試劑是否有效，從而確保免疫組化染色技術(shù)最佳化和結(jié)果的有效性。理想狀況的對照是將一個已知的抗原表達情況的組織和待檢測樣本置于同一張切片上進行染色，確保所有試劑同時與待檢測樣本和對照組織反應(yīng)，最大限度地保證二者檢測條件的一致性[5-8]。免疫組化染色結(jié)果的判讀包括兩個方面，即定性分析和定量分析，因此設(shè)置的陽性對照不僅要滿足驗證目的抗原的存在與否，而且不同的陽性對照組織要反應(yīng)出抗原表達水平的弱強。設(shè)置陽性對照還應(yīng)該遵循適用免疫組化染色的檢測下限(lowlimitofdetection，LLOD)原則，即在已知的低表達某一抗原蛋白的組織或細胞成分中能觀察到陽性反應(yīng)[9-10]。

單一組織做陽性對照，不僅不能滿足免疫組化陽性、陰性對照等上述要求，而且實際工作中三甲醫(yī)院病理科應(yīng)用抗體數(shù)量一般達百余種，每種抗體設(shè)立陽性對照，需要的陽性對照蠟塊必定很多，切好備用的對照片種類及數(shù)量相應(yīng)更多，實際應(yīng)用中易造成工作程序復(fù)雜，桌面混亂不整潔，對照片使用錯誤等情況。因此利用組織微陣列做免疫組化染色對照成為免疫組化質(zhì)量控制的利器。本組織微陣列體系的構(gòu)建是根據(jù)實際臨床工作經(jīng)驗，在遵循國際特殊專家委員會建議、免疫組織化學(xué)檢測技術(shù)共識的基礎(chǔ)上，由多年免疫組化操作經(jīng)驗技師與具有免疫組化診斷經(jīng)驗的高年資病理診斷醫(yī)師共同構(gòu)建的，5個組織微陣列可滿足我科室130多種抗體的免疫組化染色中對照使用。1號組織微陣列覆蓋的抗體范圍達60余種，主要用于標(biāo)記淋巴瘤，肺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的鑒別診斷抗體；2號組織微陣列為診斷上皮來源腫瘤、乳腺癌、宮頸癌的抗體對照；3號組織微陣列提供了來源間皮、甲狀腺、腎臟、胎盤、胃等部位的抗體對照；4號組織微陣列提供了腱鞘巨細胞腫瘤、間質(zhì)瘤、前列腺及睪丸腫瘤的鑒別診斷抗體對照；5號微陣列專門針對乳腺癌、胃癌等染Her-2提供對照[11-12]。組織微陣列構(gòu)成可根據(jù)科室自身情況靈活調(diào)整，尤其是科內(nèi)罕見病的特殊對照，如：標(biāo)記惡性黑色素瘤melanA，標(biāo)記基因異位型腎細胞癌的TFE-3等需要專門留取。

傳統(tǒng)組織微陣列蠟塊的制作需要組織芯片儀等儀器設(shè)備，過程繁瑣，對技師技能和石蠟品質(zhì)要求較高，因打孔位置不準(zhǔn)確、凝蠟程度把握不到位等，易出現(xiàn)石蠟碎裂、組織塌陷或切片時組織蹦飛等情況[13-14]，實際操作困難。本組織微陣列蠟塊制作方法優(yōu)點頗多：技術(shù)方面，操作簡單，無需制備空白蠟塊、無需打孔、定位、注芯等精確度高、難度系數(shù)較大的操作，每個微陣列組織數(shù)量約4～5個，所需組織來源廣泛，包埋時保證埋平即可，不額外增加制作難度；病理診斷安全方面，選取的對照組織是滿足臨床病理診斷需求剩余的組織，而不是在原病理診斷的蠟塊上鉆取組織，不僅保護了病理診斷的原始蠟塊，還使得病理標(biāo)本發(fā)揮更多有益作用；在經(jīng)濟方面，利用廢舊的一次性病理刀片切割組織，不需要購買組織芯片儀、組織芯片穿刺針等儀器設(shè)備，也無需購置價格昂貴的高純度切片石蠟，不增加科室額外支出。

該組織微陣列總面積約0.5 cm×0.5 cm，占用玻片面積小，不妨礙待測試組織裱貼，適用于手工染色及自動染色機染色。組織微陣列貼裱于載玻片距底端0.5 cm處，不會造成因測試組織位置過高而引起的試劑浪費，如leica bond max自動染色機，還可防止其covertile邊框把玻片邊緣的組織抹掉，保證了對照組織在染色過程中的完整性。被測試組織均位于對照微陣列的同一個方向，可方便診斷醫(yī)師閱片，且整齊美觀。

簡言之，本組織微陣列對照方法科學(xué)合理，既保留了組織微陣列體積小、通量高、靈活性強、檢測試劑與實驗條件一致性、實驗誤差小等優(yōu)點[15-16]，還具備經(jīng)濟節(jié)約、操作簡單、實用性強的特點。不僅滿足免疫組化染色質(zhì)控要求，而且操作簡單，經(jīng)濟實用，大大提高工作效率，符合免疫組化染色標(biāo)準(zhǔn)，值得在實際臨床免疫組化染色工作中推廣。