高 雪 吳玲玲 倫恒忠

泰安市中心醫(yī)院檢驗科,山東 泰安 271000

流感嗜血桿菌俗稱流感桿菌，是一種常見的革蘭氏陰性菌，需氧或兼性厭氧生長，常寄居在人上呼吸道，當(dāng)機體免疫力低下時可引起呼吸道感染。流感嗜血桿菌是兒童呼吸道感染的重要病原菌之一，嚴(yán)重者可引起兒童肺炎、腦膜炎等。近年來，隨著流感嗜血桿菌對β-內(nèi)酰胺酶類抗生素的敏感性降低以及多耐藥菌株的出現(xiàn)，臨床對該病的治療難度明顯增加。本研究以近1年來我院收治的呼吸道感染患兒為研究對象，探究流感嗜血桿菌的流行趨勢及耐藥情況，以了解流感嗜血桿菌流行趨勢及耐藥狀況，為本地區(qū)兒童流感嗜血桿菌感染的治療提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2019年1月—2019年12月期間，我院住院兒科患者自痰、支氣管灌洗液、咽拭子等標(biāo)本分離到的188株臨床樣本，剔除同一患者同次住院、相同部位分離的菌株。

1.2 標(biāo)本采集

所有患兒均于抗生素應(yīng)用前留取痰液、氣管灌洗液、咽拭子等標(biāo)本。標(biāo)本合格判定標(biāo)準(zhǔn)：痰液：低倍鏡下觀察每視野鱗狀上皮細(xì)胞<10個；氣管灌洗液：鏡檢鱗狀上皮細(xì)胞<1%總細(xì)胞數(shù)；所有標(biāo)本留取后均在2 h以內(nèi)送檢。

1.3 主要試劑及儀器

萬古霉素巧克力平板、流感嗜血桿菌藥敏實驗專用培養(yǎng)基購自鄭州安圖生物科技股份有限公司；V因子、X因子、藥敏紙片、頭孢硝噻吩紙片購自英國OXOID；細(xì)菌鑒定儀ATB Expression及革蘭氏陰性菌API-NH鑒定卡購自法國梅里埃。

1.4 菌落鑒定

將標(biāo)本接種于含有萬古霉素的巧克力平板上，置于35 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，孵育完成后挑取無色或灰白色、透明或半透明的單個微小菌落，在血瓊脂平板上進(jìn)行衛(wèi)星試驗并行革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果符合者最后在ATB Expression細(xì)菌儀鑒定。

1.5 藥物敏感實驗

挑取單個流感嗜血桿菌菌落，配成濃度為0.5 MCF單位的菌懸液，用無菌棉簽均勻涂抹在流感嗜血桿菌藥敏實驗專用培養(yǎng)基上，用K-B法進(jìn)行檢測，結(jié)果參照2016年美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會的標(biāo)準(zhǔn)判斷。

1.6 β-內(nèi)酰胺酶檢測

采用頭孢硝噻吩紙片法，室溫平衡紙片后，無菌去離子水浸濕紙片，用無菌環(huán)刮取少量流感嗜血桿菌菌落涂抹在紙片表面，觀察紙片顏色，變紅為陽性，否則為陰性。

1.7 質(zhì)控菌株

流感嗜血桿菌ATCC49247; 金黃色葡萄球菌ATCC29213；糞腸球菌ATCC29212。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

藥敏實驗采用軟件WHONET5.6進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，統(tǒng)計學(xué)結(jié)果采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)本分布

188株流感嗜血桿菌，其中154株來源于痰液，24株來源于咽拭子，7株來源于氣管灌洗液，3株來源于鼻腔分泌物。見表1。

表1 流感嗜血桿菌分離標(biāo)本分布

2.2 性別及年齡構(gòu)成

188例兒科病患中，男性患兒119例，占63.3%；女性患兒69例，占36.7%。年齡構(gòu)成：小于1歲嬰幼兒88例，占46.8%；1～5歲患兒77例，占40.9%；6～14歲兒童23例，占12.3%；統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，5歲以下兒童占有顯著比例，見表2。

表2 流感嗜血桿菌感染患兒年齡分布

2.3 β-內(nèi)酰胺酶耐藥

188株流感嗜血桿菌中，有156株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，產(chǎn)酶率為83.5%。

2.4 藥物敏感實驗

188株流感嗜血桿菌對氨芐西林、復(fù)方新諾明敏感性均小于30%；頭孢噻肟、亞胺培南、美洛培南、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星以及阿奇霉素敏感性均為100%，對頭孢呋辛、四環(huán)素、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、氯霉素耐藥范圍為3.2%～41.5%，見表3。

表3 流感嗜血桿菌耐藥

3 討 論

流感嗜血桿菌是一種條件致病菌，各年齡階段的人群均可感染，老年人和兒童是易感人群。近年來，研究顯示兒童可占該菌全部感染人群的48.13%之多[1]，是兒童呼吸道感染的重要致病菌之一。

流感嗜血桿菌可引起兒童中耳炎、鼻-鼻竇炎、腺樣體肥大等，嚴(yán)重者可引起肺炎、腦膜炎。流感嗜血桿菌通過黏附侵入呼吸道上皮細(xì)胞、外膜蛋白改變等機制逃脫機體吞噬，長期在人呼吸道定植，最終導(dǎo)致感染發(fā)生。

本研究中，流感嗜血桿菌主要分離自呼吸道分泌物，其中痰最多，占82.1%，其次為咽拭子，占12.7%，支氣管肺泡灌洗液占3.7%，此外,鼻咽分泌物占1.5%。本研究中所分離流感嗜血桿菌感染患者中，男性患兒(63.3%)所占比例高于女性(36.7%)，提示男性兒童可能更容易受該菌感染，與國內(nèi)他人研究趨勢基本一致[2]。另外，患兒的年齡構(gòu)成比例中，嬰幼兒及學(xué)齡前兒童所占比例較大，結(jié)果顯示，≤5歲患兒占87.7%，較>5歲兒童對流感嗜血桿菌易感，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義，與他人報道的以3歲以下兒童為主稍有不同，考慮與地域及流行菌株不同有關(guān)[3]，說明本地區(qū)5歲以下嬰幼兒是流感嗜血桿菌感染的高危人群，分析其原因和幼兒鼻腔中無鼻毛、鼻粘膜柔弱易受到感染，氣管與支氣管的管腔相對狹窄，黏液分泌少以及纖毛運動性差等因素有關(guān)。

由于近年來抗菌藥物的廣泛使用及環(huán)境變換等諸多因素，流感嗜血桿菌的耐藥性呈上升趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生率為83.5%，高于本地區(qū)2016—2017年朱剛等人[4]產(chǎn)酶率51.84%～57.61%的報道，分析除了耐藥率有所上升以外，也和分離病菌感染人群不同有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，耐藥情況最嚴(yán)重的抗生素為氨芐西林，耐藥率為83.5%；其中β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生率和氨芐西林耐藥率相符，未發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶陰性的氨芐西林耐藥菌株，提示氨芐西林耐藥全部是因為耐藥菌株產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶所致。常見的β-內(nèi)酰胺酶包括TEM-1和ROB-1L兩種，大多數(shù)菌株產(chǎn)生的酶以TEM-1為主，該機制由質(zhì)粒介導(dǎo)，部分為質(zhì)粒接合子，并攜帶完整的TnA型轉(zhuǎn)座子及其他耐藥基因；而產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥菌株常?？紤]是細(xì)菌細(xì)胞壁上青霉素結(jié)合蛋白改變所致，青霉素結(jié)合蛋白活性位點發(fā)生改變后，與藥物的親和力減弱，從而導(dǎo)致耐藥發(fā)生；另外，β-內(nèi)酰胺酶陰性耐藥菌株也與細(xì)菌外膜蛋白改變有關(guān)[5]；本研究結(jié)果提示，氨芐西林已不適為治療流感嗜血桿菌感染的首選抗生素。另外，復(fù)方新諾明的耐藥率為75.5%，說明磺胺類藥物亦已不宜作為流感嗜血桿菌感染的治療藥物，該藥物的耐藥可能是過度產(chǎn)生雙清葉酸還原酶，導(dǎo)致細(xì)菌對甲氧芐啶親和力發(fā)生改變所致[6]。本實驗研究氨芐西林及復(fù)方新諾明耐藥率比2018年CHINET中國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測報告(氨芐西林耐藥率：57.2%，復(fù)方新諾明耐藥率：61.6%)有所升高。另外，細(xì)菌的生物膜耐藥也是值得關(guān)注的耐藥機制之一[7]。

不同研究顯示，各地關(guān)于流感嗜血桿菌耐藥情況不盡相同。杭州地區(qū)兒童流感嗜血桿菌近年對氨芐西林和復(fù)方磺胺甲惡唑的耐藥率分別為29.64%和43.57%，對阿奇霉素和亞胺培南的耐藥較低，分別為0.36%和0.71%[8]。 北京地區(qū)兒童350株流感嗜血桿菌對甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥率最高，為76.9%；其次是氨芐西林為52.0%；對β-內(nèi)酰胺酶以外抗菌藥物，最敏感的是環(huán)丙沙星，耐藥率為0.9%，其次為氯霉素，耐藥率為1.1%[9]。太原地區(qū)自兒童呼吸道分離1 316株流感嗜血桿菌，其中有733株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶(產(chǎn)酶率為55.7%)；產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥菌株為89株,占6.8%；甲氧芐啶-磺胺甲惡唑的耐藥率最高,為67.0%；其次為氨芐西林,耐藥率為62.5%；對頭孢呋辛的耐藥率為32.3%；對阿莫西林/克拉維酸、阿奇霉素的非敏感率分別為7.2%、28.8%[10]。鄭州地區(qū)兒童感染流感嗜血桿菌對氨芐西林、復(fù)方新諾明以及頭孢唑林的耐藥性均達(dá)到70%以上,對左氧氟沙星、美羅培南、亞胺培南以及阿莫西林/克拉維酸的耐藥性最低[11]。西南成都地區(qū)流感嗜血桿菌對氨芐西林、頭孢克洛、頭孢呋辛的耐藥率均高于50%，且總體呈上升趨勢；而對頭孢噻肟、利福平、氧氟沙星的耐藥率均小于6%[12]。

本研究中，所分離188株流感嗜血桿菌對頭孢噻肟、亞胺培南、美洛培南、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星以及阿奇霉素敏感性均為100%。但在臨床使用中，亞胺培南通常用于臨床重癥感染，而環(huán)丙沙星及左氧沙星由于關(guān)節(jié)毒性等影響兒童身心發(fā)育，亦不能作為常規(guī)一線藥物使用，因此考慮將頭孢噻肟、美羅培南、阿奇霉素作為兒童流感嗜血桿菌感染的常規(guī)使用藥物。

綜上所述，流感嗜血桿菌是引起兒童呼吸道感染的重要致病菌，其對常用抗生素敏感性差異較大，工作中應(yīng)注意檢測流感嗜血桿菌的耐藥性變化，為臨床抗菌藥物的合理使用提供保障與依據(jù)。