陳 存，丁昌俊，黃秦軍，李政宏，張 靜，劉 寧，李 波，蘇曉華

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091)

豐富的種質(zhì)資源為植物育種、遺傳研究和新品種選育提供了條件和物質(zhì)基礎(chǔ)[1-2]。為更好地應(yīng)對(duì)當(dāng)前氣候條件變化，急需培育出適宜在不同條件下生長(zhǎng)的新品種，同時(shí)合理保護(hù)和利用植物種質(zhì)資源是一項(xiàng)復(fù)雜的任務(wù)。在原始種質(zhì)資源中挑選少部分有代表性的種質(zhì)構(gòu)建核心種質(zhì)庫(kù)可以最大限度地保存其表型或遺傳多樣性，從而有效地解決種質(zhì)資源保存中成本高等問(wèn)題，縮短育種進(jìn)程，促進(jìn)種質(zhì)資源的合理開(kāi)發(fā)和利用[3-4]。

與作物種質(zhì)資源核心種質(zhì)庫(kù)構(gòu)建相關(guān)的研究已有眾多報(bào)道[5-8]，其構(gòu)建方法、策略和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)均相對(duì)成熟。參考作物核心種質(zhì)庫(kù)的構(gòu)建策略，多種木本植物核心種質(zhì)庫(kù)已構(gòu)建成功，包括葡萄（Vitis viniferaL.）[9]、油橄欖（Olea europaeaL.）[10]和角豆（Ceratonia siliquaL.）[11]等經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，歐洲黑楊（Populus nigraL.）[12]、木荷（Schima superbaGardn. et Champ.）[13]、杉木（Cunninghamia lanceolata(Lamb.) Hook.）[14]和馬 尾松（Pinus massonianaL.）[15]等用材林樹(shù)種。當(dāng)前，構(gòu)建核心種質(zhì)庫(kù)所選用的數(shù)據(jù)因研究目的不同，主要有表型數(shù)據(jù)或基因型數(shù)據(jù)[16]。植株的表型數(shù)據(jù)測(cè)量方便，在核心種質(zhì)庫(kù)的構(gòu)建研究中應(yīng)用廣泛，同時(shí)隨著分子標(biāo)記技術(shù)和基因組測(cè)序技術(shù)在核心種質(zhì)庫(kù)構(gòu)建研究中的應(yīng)用，相關(guān)學(xué)者越發(fā)認(rèn)識(shí)到植物表型研究的重要性和必要性。育種研究最終目的是獲得具有特定性狀和表型的新品種[7,17]，因此，基于表型數(shù)據(jù)構(gòu)建核心種質(zhì)庫(kù)仍是未來(lái)種質(zhì)資源研究的重要內(nèi)容。由于不同物種具有不同的表型特征和群體結(jié)構(gòu)，在構(gòu)建核心種質(zhì)庫(kù)的研究中采用的取樣策略不同，均具有一定的優(yōu)缺點(diǎn)，如隨機(jī)取樣策略可以更好的保存原始種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)，但構(gòu)建的核心種質(zhì)庫(kù)的代表性和多樣性相對(duì)較差；偏離度取樣可以保留較大的變異和多樣性；位點(diǎn)優(yōu)先取樣策略不僅可以保留具有性狀極值的種質(zhì)，同時(shí)可以較好的保留群體結(jié)構(gòu)[18-19]。因此，研究者應(yīng)根據(jù)所研究種質(zhì)資源的特點(diǎn)選擇合適的取樣策略。

美洲黑楊（Populus deltoidesMarsh.）種質(zhì)資源在楊樹(shù)育種研究工作中占有重要地位[20-21]，合理保護(hù)其表型和遺傳多樣性是高效開(kāi)發(fā)和利用美洲黑楊種質(zhì)資源的前提，本課題組通過(guò)前期對(duì)其表型和遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)原始種質(zhì)資源庫(kù)具有豐富的多樣性[22]。為了更好地保存美洲黑楊種質(zhì)資源，有研究者利用分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建其核心種質(zhì)庫(kù)[23-24]，但基于表型數(shù)據(jù)構(gòu)建美洲黑楊核心種質(zhì)庫(kù)的研究仍未見(jiàn)報(bào)道。本研究基于美洲黑楊種質(zhì)資源表型和生理性狀，分析其群體結(jié)構(gòu)，對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行分組，利用分組逐步聚類(lèi)取樣的方法構(gòu)建表型核心種質(zhì)庫(kù)；通過(guò)與3 種常規(guī)取樣策略進(jìn)行比較，首次提出性狀頻率取樣策略并用于構(gòu)建美洲黑楊表型核心種質(zhì)庫(kù)；在表型核心種質(zhì)庫(kù)的基礎(chǔ)上通過(guò)補(bǔ)充部分種質(zhì)構(gòu)建表型優(yōu)化核心種質(zhì)庫(kù)，使其表型保留比例達(dá)到100.00%，最大化保存種質(zhì)資源的表型多樣性信息。本研究有助于研究者更好的了解、保護(hù)和利用美洲黑楊種質(zhì)資源，挖掘資源中的核心種質(zhì)，為楊樹(shù)育種研究及其他物種表型核心種質(zhì)庫(kù)構(gòu)建奠定基礎(chǔ)和提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究中的試驗(yàn)材料包括美洲黑楊6 個(gè)種源群體、27 個(gè)采樣點(diǎn)的258 個(gè)無(wú)性系（表1）。種質(zhì)來(lái)源地包括哥倫比亞河流域（美國(guó)華盛頓州，Was）、北美洲圣勞倫斯河流域（加拿大魁北克省，Que）和密西西比河流域（美國(guó)密蘇里州，Mis；艾奧瓦州，Iow；田納西州，Ten；路易斯安那州，Lou）。試驗(yàn)材料與前期研究中的材料來(lái)源信息一致[22]。

1.2 植株培養(yǎng)及表型生理指標(biāo)的測(cè)定

將美洲黑楊植株1 年生枝條剪成插穗，扦插于營(yíng)養(yǎng)缽中（口徑18 cm，高度25 cm），每個(gè)無(wú)性系扦插10 株，在中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院通州試驗(yàn)基地（39°73′35″ N，116°75′18″ E）溫室大棚進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基質(zhì)為黃土:粗砂石:草炭土 = 6:1:1。

在植株生長(zhǎng)季，同時(shí)利用3 臺(tái)Li-6400 便攜式光合測(cè)定儀（Li-6400，LI-COR，美國(guó)）測(cè)定植株葉片的凈光合速率（Pn）、胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和蒸騰速率（Tr），測(cè)定葉片為上部第5～7 片成熟葉片，每個(gè)無(wú)性系測(cè)定3 株。測(cè)量過(guò)程中充分考慮儀器、測(cè)量時(shí)間和環(huán)境等因素對(duì)測(cè)量指標(biāo)的影響，將258 個(gè)無(wú)性系分為9 組，每組28～29 個(gè)無(wú)性系，測(cè)量時(shí)間分為3 個(gè)時(shí)間段（9：00—9：40、9：40—10：20 和10：20—11：00），每臺(tái)儀器在1 個(gè)時(shí)間段內(nèi)可以完成1 組無(wú)性系1 株植株的1 個(gè)葉片光合參數(shù)的測(cè)量，最終使每個(gè)無(wú)性系測(cè)定的3 株的9 片葉片中每臺(tái)儀器在每個(gè)時(shí)間段各測(cè)定1 片，1 個(gè)生物學(xué)重復(fù)的測(cè)量周期為3 d，共測(cè)量9 d。使用葉綠素相對(duì)含量測(cè)定儀（SPAD-502，日本）測(cè)定植株上部第5～7 片成熟葉片的SPAD值，每個(gè)葉片選取6 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，每個(gè)無(wú)性系測(cè)定3 株。

每個(gè)無(wú)性系選取3 株生長(zhǎng)性狀相似的植株，各采集3～5 片成熟功能葉，稱(chēng)鮮質(zhì)量，使用葉面積儀（Yaxin-1241，北京）測(cè)量葉片形態(tài)性狀（長(zhǎng)度、寬度和葉面積），然后使其風(fēng)干稱(chēng)風(fēng)干質(zhì)量，最后烘干并稱(chēng)烘干質(zhì)量。利用元素分析儀（Thermo Fisher Scientific，Inc.，美國(guó)），測(cè)定烘干葉片中的碳、氮元素的含量。

在植株生長(zhǎng)后期，測(cè)量植株的株高、地徑和葉片數(shù)（葉痕數(shù)），同時(shí)對(duì)根系和莖段的生長(zhǎng)量（干質(zhì)量和鮮質(zhì)量）進(jìn)行測(cè)定。

表1 美洲黑楊種質(zhì)資源來(lái)源信息Table 1 Source information of P. deltoides germplasm resources

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用葉片的鮮質(zhì)量、風(fēng)干質(zhì)量和烘干質(zhì)量計(jì)算葉片自由水和結(jié)合水的含量，即自由水含量 = 鮮質(zhì)量-風(fēng)干質(zhì)量；結(jié)合水含量 = 風(fēng)干質(zhì)量-烘干質(zhì)量。

表型多樣性指數(shù)（Shannon-Wiener 指數(shù)，H'）的計(jì)算公式為：

式中：H'為Shannon-Wiener 指數(shù)；ln 表示自然對(duì)數(shù)；n為性狀指標(biāo)總數(shù)；Pi表示某性狀指標(biāo)第i種級(jí)別的無(wú)性系數(shù)占總無(wú)性系數(shù)的比率，各性狀指標(biāo)被劃分為10 個(gè)級(jí)別，數(shù)值小于為第1 級(jí)別，數(shù)值大于等于為第10 級(jí)別，其中，每0.5σ劃分為一個(gè)級(jí)別。

無(wú)性系性狀頻率的計(jì)算公式為：

式中：Fj為第j個(gè)無(wú)性系的性狀頻率；n為性狀指標(biāo)總數(shù)；Pij表示種質(zhì)庫(kù)中第j個(gè)無(wú)性系的第i個(gè)性狀指標(biāo)所在的性狀級(jí)別的頻率。

1.4 表型核心種質(zhì)庫(kù)構(gòu)建策略

利用表型和生理指標(biāo)數(shù)據(jù)對(duì)6 個(gè)種源、258 個(gè)美洲黑楊無(wú)性系進(jìn)行分組，Was 種源的無(wú)性系單獨(dú)為一組；Que 和Iow 種源無(wú)性系為一組；Mis、Lou和Ten 種源無(wú)性系為一組?；跓o(wú)性系標(biāo)準(zhǔn)化的表型和生理指標(biāo)數(shù)據(jù)計(jì)算每組內(nèi)無(wú)性系間的歐式距離，采用可變類(lèi)平均法對(duì)無(wú)性系進(jìn)行聚類(lèi)分析，在最低聚類(lèi)水平上分別采用隨機(jī)取樣、偏離度取樣和位點(diǎn)優(yōu)先取樣的策略構(gòu)建表型核心種質(zhì)庫(kù)。同時(shí)，本研究首次提出性狀頻率取樣策略，即在聚類(lèi)的最低級(jí)別的兩個(gè)或多個(gè)無(wú)性系中優(yōu)先選擇具有性狀極值的無(wú)性系，如果均具有性狀極值均進(jìn)入下一輪聚類(lèi)分析，如果均沒(méi)有性狀極值則選擇性狀頻率低的無(wú)性系進(jìn)入下一輪聚類(lèi)分析，以此類(lèi)推，直到構(gòu)建的種質(zhì)庫(kù)不滿(mǎn)足核心種質(zhì)庫(kù)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 表型核心種質(zhì)庫(kù)代表性檢驗(yàn)方法

參照前期研究中表型核心種質(zhì)庫(kù)的檢測(cè)方法，通過(guò)計(jì)算構(gòu)建的種質(zhì)庫(kù)相對(duì)于原始種質(zhì)庫(kù)的極差符合率（CR）、變異系數(shù)變化率（VR）、均值差異百分率（MD）、方差差異百分率（VD）和表型保留比例（RPR）對(duì)種質(zhì)庫(kù)的代表性進(jìn)行評(píng)價(jià)，各參數(shù)的計(jì)算公式[5,18]如下：

式中：RC(i)是核心種質(zhì)第i個(gè)性狀的極差，RI(i)是原始種質(zhì)第i個(gè)性狀的極差，n是性狀總數(shù)。

式中：CVC(i)是核心種質(zhì)第i個(gè)性狀的變異系數(shù)，CVI(i)是原始種質(zhì)第i個(gè)性狀的變異系數(shù)，n是性狀總數(shù)。

式中：St是核心種質(zhì)與原始種質(zhì)進(jìn)行t測(cè)驗(yàn)得到的均值差異顯著（α= 0.05）的性狀數(shù)，n是性狀總數(shù)。

式中：SF是核心種質(zhì)與原始種質(zhì)進(jìn)行F測(cè)驗(yàn)得到的方差差異顯著（α= 0.05）的性狀數(shù)，n是性狀總數(shù)。

式中：MC(i)是核心種質(zhì)第i個(gè)性狀的表現(xiàn)型個(gè)數(shù)，MI(i)是原始種質(zhì)第i個(gè)性狀的表現(xiàn)型個(gè)數(shù)，n是性狀總數(shù)。

通過(guò)計(jì)算各個(gè)種質(zhì)庫(kù)各個(gè)性狀指標(biāo)的表型多樣性指數(shù)（H'）對(duì)種質(zhì)庫(kù)的多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)?；谥鞒煞址治鰳?gòu)建的前2 個(gè)主成分因子的得分，繪制原始種質(zhì)庫(kù)和表型核心種質(zhì)庫(kù)的分布圖，對(duì)表型核心種質(zhì)庫(kù)進(jìn)行確認(rèn)。

表型核心種質(zhì)庫(kù)構(gòu)建的最低標(biāo)準(zhǔn)為：MD＜20.00%且CR＞ 80.00%，RPR經(jīng)常作為評(píng)價(jià)表型核心種質(zhì)庫(kù)有效性和取樣比例必不可少的參數(shù)，本研究要求核心種質(zhì)庫(kù)的RPR＞ 90.00%，同時(shí)認(rèn)為MD越小，CR、VR和VD越大表型核心種質(zhì)庫(kù)越能代表原始種質(zhì)庫(kù)的多樣性[18]。

1.6 優(yōu)化核心種質(zhì)庫(kù)構(gòu)建策略

在原始種質(zhì)庫(kù)中挑選出表型核心種質(zhì)庫(kù)后剩余的種質(zhì)稱(chēng)為保留種質(zhì)?；诒硇捅Ａ舯壤畲蠡乃枷耄≧PR= 100.00%），分析并統(tǒng)計(jì)表型核心種質(zhì)庫(kù)相對(duì)于原始種質(zhì)庫(kù)中各性狀指標(biāo)丟失的表型類(lèi)型，然后在保留種質(zhì)中挑選最少數(shù)量的具備相應(yīng)表型的無(wú)性系補(bǔ)充到表型核心種質(zhì)庫(kù)中形成表型優(yōu)化核心種質(zhì)庫(kù)，當(dāng)多個(gè)無(wú)性系均具有相應(yīng)表型類(lèi)型時(shí)，選擇性狀頻率低的無(wú)性系，該部分無(wú)性系稱(chēng)為表型補(bǔ)充種質(zhì)，最后對(duì)表型優(yōu)化核心種質(zhì)庫(kù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類(lèi)群表型和生理特征分析

對(duì)美洲黑楊3 個(gè)類(lèi)群的表型和生理指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比分析（表2），發(fā)現(xiàn)第1 類(lèi)群（Was 種源）無(wú)性系的株高（H）、葉片數(shù)（LN）、葉片碳元素含量（C）、葉片氮元素含量（N）、Pn和Tr高于另外2個(gè)類(lèi)群的無(wú)性系；第2 類(lèi)群（Iow 和Que 種源）無(wú)性系的根系鮮質(zhì)量（RFW）、根系干質(zhì)量（RDW）和葉綠素相對(duì)含量（SPAD）最大；第3 類(lèi)群（Mis、Lou 和Ten 種源）無(wú)性系的地徑（GD）、莖段和葉片的生長(zhǎng)量、葉片形態(tài)性狀、葉片自由水和結(jié)合水含量、Gs和Ci均高于另外2 個(gè)類(lèi)群。3 個(gè)類(lèi)群的表型和生理特征均比較明顯，在該分組的基礎(chǔ)上分別在組內(nèi)篩選代表性的無(wú)性系構(gòu)建核心種質(zhì)庫(kù)可以更好的代表美洲黑楊群體的表型和生理特征。

表2 不同類(lèi)群表型和生理指標(biāo)特征分析Table 2 Phenotypic and physiological characteristics of different groups

2.2 不同取樣策略核心種質(zhì)庫(kù)構(gòu)建

在構(gòu)建美洲黑楊表型核心種質(zhì)庫(kù)時(shí)，基于不同的取樣策略得到的結(jié)果存在較大差異（表3）。采用隨機(jī)取樣策略時(shí)，構(gòu)建的第6 個(gè)種質(zhì)庫(kù)（R6）的RPR為87.57%，低于90.00%，初步認(rèn)定第5 個(gè)種質(zhì)庫(kù)（R5）為核心種質(zhì)庫(kù)，包括32 個(gè)無(wú)性系，取樣比例為12.40%，MD、VD、CR、VR和RPR分別為0.00%、9.52%、85.69%、116.31%和91.90%；采用偏離度取樣策略時(shí)，共構(gòu)建了5 個(gè)種質(zhì)庫(kù)，第4 個(gè)種質(zhì)庫(kù)（D4）被初步認(rèn)定為核心種質(zhì)庫(kù)，取樣比例為19.38%，MD、VD、CR、VR和RPR分別為9.52%、28.57%、93.17%、113.44%和94.71%；采用位點(diǎn)優(yōu)先取樣策略時(shí)，共構(gòu)建了8 個(gè)種質(zhì)庫(kù)，第8 個(gè)種質(zhì)庫(kù)（P8）的RPR低于90.00%，初步確定第7 個(gè)種質(zhì)庫(kù)（P7）為核心種質(zhì)庫(kù)，包括32 個(gè)無(wú)性系，MD、VD、CR、VR和RPR分別為0.00%、76.19%、100.00%、141.66% 和91.69%；采用性狀頻率取樣策略時(shí)，共構(gòu)建了10 個(gè)種質(zhì)庫(kù)，第10個(gè)種質(zhì)庫(kù)（F10）的RPR為89.89%，第9 個(gè)種質(zhì)庫(kù)（F9）被初步認(rèn)定為核心種質(zhì)庫(kù)，取樣比例為10.47%，MD、VD、CR、VR和RPR分別為0.00%、80.95%、100.00%、148.94%和90.85%。在隨機(jī)取樣、偏離度取樣和位點(diǎn)優(yōu)先取樣策略下形成的種質(zhì)庫(kù)之間H'沒(méi)有顯著的變化，而在性狀頻率取樣策略下，H'在不同種質(zhì)庫(kù)間存在明顯差異，隨著取樣比例的減少，H'先增大后減小，但在4 種不同的取樣策略下構(gòu)建的核心種質(zhì)庫(kù)的H'與原始種質(zhì)庫(kù)均沒(méi)有顯著差異，均能代表原始種質(zhì)庫(kù)表型和生理性狀的多樣性。

表3 不同取樣策略種質(zhì)庫(kù)對(duì)比分析Table 3 Comparative analysis of banks with different sampling strategies

通過(guò)對(duì)比不同取樣策略下構(gòu)建的核心種質(zhì)庫(kù)的評(píng)價(jià)參數(shù)可以看出：通過(guò)性狀頻率取樣策略構(gòu)建的核心種質(zhì)庫(kù)在取樣比例最低的前提下，MD為0.00%，VD、CR和VR均高于另外3 種取樣策略，代表性最好，而且在構(gòu)建核心種質(zhì)庫(kù)的過(guò)程中，性狀頻率可以更好的對(duì)無(wú)性系進(jìn)行區(qū)分，表明性狀頻率取樣策略在構(gòu)建美洲黑楊表型核心種質(zhì)庫(kù)的研究中是可行的，而且優(yōu)于隨機(jī)取樣、偏離度取樣和位點(diǎn)優(yōu)先取樣的策略。

2.3 表型核心種質(zhì)庫(kù)和表型優(yōu)化核心種質(zhì)庫(kù)的構(gòu)建

通過(guò)對(duì)比不同取樣策略構(gòu)建的核心種質(zhì)庫(kù)的有效性，最終采用性狀頻率取樣策略構(gòu)建美洲黑楊表型核心種質(zhì)庫(kù)。核心種質(zhì)庫(kù)共包括27 個(gè)無(wú)性系，在第1、第2、第3 類(lèi)群中分別選取了2、15、10個(gè)無(wú)性系，在每個(gè)種源中均有無(wú)性系被選擇(表4)，說(shuō)明取樣策略具有一定的代表性和廣泛性。

表4 原始種質(zhì)庫(kù)、表型核心種質(zhì)庫(kù)與表型優(yōu)化核心種質(zhì)庫(kù)的組成Table 4 The composition of original, phenotypic core and phenotypic optimize core banks

表型核心種質(zhì)庫(kù)的RPR為90.85%（表3)，通過(guò)與原始種質(zhì)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)：其在14 個(gè)表型和生理性狀上共缺失了19 個(gè)表現(xiàn)型，為了使RPR達(dá)到100.00%，在保留種質(zhì)中挑選最少數(shù)的無(wú)性系，使其表型和生理性狀包括缺失的19 個(gè)表現(xiàn)型，最終篩選出5 個(gè)美洲黑楊無(wú)性系為補(bǔ)充種質(zhì)，補(bǔ)充到表型核心種質(zhì)中，形成表型優(yōu)化核心種質(zhì)庫(kù)。表型優(yōu)化核心種質(zhì)庫(kù)的取樣比例為12.40%，共32 個(gè)美洲黑楊個(gè)體，其中，Was、Que、Iow、Lou、Ten和Mis 種源各選擇了2、16、1、5、7、1 個(gè)無(wú)性系(表4)。表型優(yōu)化核心種質(zhì)庫(kù)的MD、VD和VR分別為0.00%、71.43%和142.19%，CR和RPR均達(dá)到了100.00%，平均表型多樣性指數(shù)為2.097(表3)，表明表型優(yōu)化核心種質(zhì)庫(kù)保留了原始種質(zhì)庫(kù)21 個(gè)表型和生理性狀的極值和10 個(gè)等級(jí)的表現(xiàn)型，極大限度地去除了冗余，可以有效地保存美洲黑楊群體的表型多樣性。

2.4 表型核心種質(zhì)庫(kù)和表型優(yōu)化核心種質(zhì)庫(kù)的確認(rèn)

為了進(jìn)一步對(duì)核心種質(zhì)庫(kù)進(jìn)行確認(rèn)，基于21 個(gè)表型和生理性狀進(jìn)行主成分分析提取的第1、第2 和第3 主成分因子得分繪制保留種質(zhì)、核心種質(zhì)和補(bǔ)充種質(zhì)的分布圖，從圖1 可看出：保留種質(zhì)的分布存在大量的重疊現(xiàn)象，表明種質(zhì)間表型相似性高，而表型核心種質(zhì)均勻分布在原始種質(zhì)范圍內(nèi)，沒(méi)有重疊現(xiàn)象，說(shuō)明核心種質(zhì)庫(kù)去除了冗余，具有良好的代表性。補(bǔ)充種質(zhì)進(jìn)一步的豐富了核心種質(zhì)的分布范圍，形成的表型優(yōu)化核心種質(zhì)庫(kù)具有更好的代表性。

圖1 保留種質(zhì)、核心種質(zhì)和補(bǔ)充種質(zhì)的 PCoA 分析Fig. 1 PCoA analysis of original, core and supplementary collection

3 討論

3.1 表型核心種質(zhì)庫(kù)構(gòu)建的分組策略

在表型核心種質(zhì)庫(kù)構(gòu)建的過(guò)程中，對(duì)原始種質(zhì)進(jìn)行合理的分組，可以提高組內(nèi)的冗余度，通過(guò)聚類(lèi)取樣可以快速鑒定相似種質(zhì)，提高核心種質(zhì)庫(kù)的表型或遺傳變異[25-26]。前期研究表明：由于基因組DNA 突變、遷移、選擇和漂變的綜合作用，使不同種源具有不同的表型和遺傳特征[27]，因此，可以基于種源地理信息對(duì)原始種質(zhì)進(jìn)行分組[28-29]；但Katinas 等[30]認(rèn)為，僅以種源地理信息為依據(jù)對(duì)種質(zhì)進(jìn)行分組可能達(dá)不到預(yù)期效果，同時(shí)結(jié)合種質(zhì)的表型或遺傳信息特征的聚類(lèi)分析結(jié)果對(duì)其進(jìn)行分組，構(gòu)建的核心種質(zhì)庫(kù)更具有代表性[8]。本研究中，基于表型和生理性狀分析美洲黑楊種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)并對(duì)其進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)不同類(lèi)群的個(gè)體間表型和生理特征差異顯著，但每個(gè)類(lèi)群內(nèi)個(gè)體間的相似性較高，因此，通過(guò)分組取樣可以快速降低資源的冗余度，有效提高種質(zhì)庫(kù)的表型變異和多樣性水平。

3.2 表型核心種質(zhì)庫(kù)構(gòu)建的取樣策略

根據(jù)不同的種質(zhì)資源特點(diǎn)制定合適的取樣策略是核心種質(zhì)庫(kù)構(gòu)建研究中首先需要解決的重要問(wèn)題。目前，常規(guī)取樣策略包括隨機(jī)取樣、偏離度取樣和位點(diǎn)優(yōu)先取樣。張歡等基于水青樹(shù)（Tetarcention sinenseOliv.）葉片表型性狀比較3 種不同取樣策略，發(fā)現(xiàn)利用位點(diǎn)優(yōu)先取樣策略構(gòu)建的核心種質(zhì)庫(kù)保留了原始種質(zhì)庫(kù)的多樣性，且種質(zhì)庫(kù)的差異水平明顯提高[31]；在構(gòu)建櫻桃番茄（Lycopersicon esculentumMill.）核心種質(zhì)庫(kù)的研究中發(fā)現(xiàn)，3 種不同取樣策略均能提高種質(zhì)庫(kù)的變異水平，其中，利用偏離度取樣策略構(gòu)建的核心種質(zhì)庫(kù)具有更好的代表性[32]；李洪果在構(gòu)建杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.）雄性資源核心種質(zhì)庫(kù)的研究中發(fā)現(xiàn)，采用位點(diǎn)優(yōu)先取樣策略構(gòu)建的核心種質(zhì)最大程度代表了原始種質(zhì)庫(kù)的表型變異特征[33]。本研究中提出的性狀頻率取樣策略，即優(yōu)先選擇具有極值的個(gè)體，然后基于性狀頻率對(duì)其他種質(zhì)進(jìn)行篩選。通過(guò)與上述3 種取樣策略比較發(fā)現(xiàn)，性狀頻率取樣策略可以更好的對(duì)種質(zhì)進(jìn)行鑒定和區(qū)分，從而有效降低種質(zhì)庫(kù)冗余，增加核心種質(zhì)庫(kù)變異水平，因此，性狀頻率取樣策略在美洲黑楊核心種質(zhì)庫(kù)構(gòu)建的研究中更加可行有效。

3.3 表型核心種質(zhì)庫(kù)構(gòu)建的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

在核心種質(zhì)庫(kù)構(gòu)建研究中如何有效對(duì)其評(píng)價(jià)至關(guān)重要。目前，主要通過(guò)與原始種質(zhì)庫(kù)的性狀均值（MD）、方差（VD）、極差（CR）和變異系數(shù)（VR）之間的差異比較，評(píng)價(jià)基于表型性狀構(gòu)建核心種質(zhì)庫(kù)的代表性，認(rèn)為在MD＜ 20.00%且CR＞80.00%時(shí)構(gòu)建的核心種質(zhì)庫(kù)有效，且MD越小，VD、CR和VD越大，核心種質(zhì)庫(kù)的代表性和多樣性越好[1,12,16,18,31]；同時(shí)RPR可以直接反映核心種質(zhì)庫(kù)保留表型性狀信息的多少，是評(píng)價(jià)其有效性必不可少的參數(shù)[5,28]。本研究中，采用MD、VD、CR、VR和RPR對(duì)美洲黑楊核心種質(zhì)庫(kù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，在常用標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上確保核心種質(zhì)庫(kù)的RPR＞ 90.00%，使其能夠保留更多的表型性狀信息，提高核心種質(zhì)庫(kù)的代表性和有效性。最終構(gòu)建的美洲黑楊表型優(yōu)化核心種質(zhì)庫(kù)的MD、VD、CR、VR和RPR分別為0.00%、71.43%、100.00%、142.19%和100.00%，并通過(guò)對(duì)比種質(zhì)性狀的主成分分布圖對(duì)表型核心種質(zhì)庫(kù)和表型優(yōu)化核心種質(zhì)庫(kù)的代表性進(jìn)行了確認(rèn)。

取樣比例是體現(xiàn)核心種質(zhì)庫(kù)代表性的重要參數(shù)，由于不同種質(zhì)資源具有豐富的多樣性，核心種質(zhì)庫(kù)的取樣比例存在差異。草本植物核心種質(zhì)庫(kù)的取樣比例主要在5.00%～40.00%之間[6,8,34]，木本植物的取樣比例則在10.00%～45.00%之間[10,15-14]。在本研究初期沒(méi)有規(guī)定核心種質(zhì)庫(kù)的取樣比例，而是按照核心種質(zhì)庫(kù)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建最小取樣比例的核心種質(zhì)庫(kù)，最終構(gòu)建的美洲黑楊表型核心種質(zhì)庫(kù)的取樣比例為10.47%，表型優(yōu)化核心種質(zhì)庫(kù)的取樣比例為12.40%。

3.4 表型核心種質(zhì)庫(kù)構(gòu)建的性狀選取及展望

利用表型數(shù)據(jù)構(gòu)建核心種質(zhì)庫(kù)是最基本、最直接且最常用的方法[29]，但表型性狀容易受到外界環(huán)境的干擾，從而影響表型核心種質(zhì)庫(kù)的有效性[28,32,35]，因此，在獲取種質(zhì)資源表型性狀數(shù)據(jù)時(shí)應(yīng)保證試驗(yàn)材料的一致性，并嚴(yán)格控制植株生長(zhǎng)的環(huán)境條件，減少材料本身及環(huán)境引起的誤差[36]；同時(shí)觀(guān)測(cè)性狀代表性、穩(wěn)定性和可比性對(duì)表型核心種質(zhì)庫(kù)的構(gòu)建具有重要影響，葉片相關(guān)的形態(tài)指標(biāo)在水青樹(shù)[31]、普通杏（Prunus armeniacaL.）[35]和灰楸（Catalpa fargesiiBur.）[37]等表型核心種質(zhì)庫(kù)的研究中得到應(yīng)用，植株生長(zhǎng)、材性和生理性狀數(shù)據(jù)也經(jīng)常作為構(gòu)建表型核心種質(zhì)庫(kù)的依據(jù)[12,27,37]。本研究中，主要利用植株生長(zhǎng)、葉片形態(tài)、葉片養(yǎng)分含量、葉片葉綠素相對(duì)含量、光合參數(shù)等表型和生理性狀構(gòu)建表型核心種質(zhì)庫(kù)。由于光合參數(shù)與植株生長(zhǎng)密切相關(guān)且易受外界環(huán)境的影響，為了保證光合數(shù)據(jù)的可比性，本研究同時(shí)使用3 臺(tái)光合儀進(jìn)行測(cè)定，并將測(cè)量時(shí)間段進(jìn)行劃分，制定合理的測(cè)量策略，從而減少測(cè)量時(shí)間、儀器和外界環(huán)境等因素的影響。

構(gòu)建美洲黑楊核心種質(zhì)庫(kù)參考的表型指標(biāo)數(shù)據(jù)可以較全面的反映植株的生長(zhǎng)特性，但表型性狀是植株基因與環(huán)境共同作用的結(jié)果，基于表型數(shù)據(jù)構(gòu)建核心種質(zhì)庫(kù)具有一定的局限性，因此，有必要結(jié)合本研究的分析結(jié)果進(jìn)一步利用分子標(biāo)記的方法分析美洲黑楊群體的遺傳結(jié)構(gòu)并構(gòu)建核心種質(zhì)庫(kù)，使得構(gòu)建的核心種質(zhì)庫(kù)同時(shí)包括美洲黑楊的表型信息和遺傳信息，從而更加有效的保存美洲黑楊種質(zhì)資源。

4 結(jié)論

美洲黑楊不同類(lèi)群之間具有明顯的表型和生理特征，Was 種源個(gè)體的高生長(zhǎng)量、葉片數(shù)和葉片養(yǎng)分含量和光合生理活性較高；Iow 和Que 種源無(wú)性系的根系生長(zhǎng)較發(fā)達(dá)；Mis、Lou 和Ten 種源無(wú)性系的莖生長(zhǎng)量、葉片生長(zhǎng)量和葉片形態(tài)高于其他類(lèi)群無(wú)性系?；诒硇秃蜕硇誀?，通過(guò)與隨機(jī)取樣、偏離度取樣和位點(diǎn)優(yōu)先取樣3 種常規(guī)取樣策略進(jìn)行比較，首次提出并確定性狀頻率取樣策略為構(gòu)建美洲黑楊表型核心種質(zhì)庫(kù)的最適取樣策略。在258 個(gè)美洲黑楊種質(zhì)中篩選出27 個(gè)核心種質(zhì)，取樣比例為10.47%。篩選了5 個(gè)種質(zhì)補(bǔ)充到表型核心種質(zhì)庫(kù)中形成表型優(yōu)化核心種質(zhì)庫(kù)，使其表型保留比例達(dá)到100.00%。通過(guò)對(duì)表型核心種質(zhì)庫(kù)和表型優(yōu)化核心種質(zhì)庫(kù)進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，表明均具有良好的代表性。美洲黑楊表型核心種質(zhì)庫(kù)和表型優(yōu)化核心種質(zhì)庫(kù)的建立可以更好的對(duì)美洲黑楊種質(zhì)資源進(jìn)行管理、保護(hù)和利用，為有效保存、管理和利用美洲黑楊種質(zhì)資源提供科學(xué)依據(jù)。