劉春華，吳東梅，劉雨暉，陳 輝，沈?qū)氋F，蔣宗塏，劉小飛＊

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)莘口教學(xué)林場，福建 三明 365002；2. 福建師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350007)

隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)化肥使用的增加和化石燃料燃燒等人類活動(dòng)的加劇，使通過大氣進(jìn)入陸地生態(tài)系統(tǒng)的氮（N）不斷增加[1-2]，已嚴(yán)重影響陸地生態(tài)系統(tǒng)碳（C）循環(huán)等關(guān)鍵生態(tài)學(xué)過程[1-4]。森林土壤C 庫是陸地生態(tài)系統(tǒng)土壤C 庫的主體（占70%），在緩解全球氣候變化中發(fā)揮重要作用[5-6]。因此，森林土壤有機(jī)碳（SOC）庫如何響應(yīng)N 沉降這一問題引起研究人員的極大關(guān)注[6-9]。研究表明，SOC 對(duì)N 沉降的響應(yīng)主要表現(xiàn)為增加、降低和無影響[8-11]。大量研究結(jié)果表明，N 沉降能增加土壤N 的有效性，提高植物的生產(chǎn)力和通過凋落物、細(xì)根向土壤輸入的碳，進(jìn)而增加SOC 積累[6,10]；也有研究表明，N 沉降通過抑制SOC 的分解來增加土壤碳，如N 沉降能降低木質(zhì)素真菌的豐度和木質(zhì)素降解細(xì)胞外酶活性，進(jìn)而降低SOC 分解速率[8,10-11]。另有研究表明，土壤pH 值在影響微生物生物量和土壤碳周轉(zhuǎn)方面起著主要作用，較低pH 值能抑制微生物活性，進(jìn)而降低SOC 分解[12-13]。然而，可溶性有機(jī)碳（DOC）作為碳循環(huán)中的重要組成部分[14]，在SOC 形成中起著重要作用，但在N 沉降背景下，DOC 在SOC 吸存中的作用尚不清楚。

土壤微生物參與了土壤大部分的生物地球化學(xué)循環(huán)過程，在森林生態(tài)系統(tǒng)碳氮循環(huán)過程中起關(guān)鍵作用[5,14]。研究表明，N 沉降能改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[15-16]。由于細(xì)菌比真菌更喜歡利用碳氮比（C/N）較低的C 源，N 沉降降低土壤C/N，有利于土壤細(xì)菌生長[17]。Meta 分析結(jié)果也表明，N 增加顯著降低微生物生物量、細(xì)菌、真菌生物量和微生物呼吸 。Wu 等 研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過8 a N 沉降試驗(yàn)后，土壤嚴(yán)重酸化，植被物種豐富度降低，進(jìn)而導(dǎo)致叢枝真菌微生物量含量下降，細(xì)菌生存脅迫指數(shù)增加。然而，這些研究結(jié)果主要來自溫帶地區(qū)，與溫帶地區(qū)不同，亞熱帶森林土壤N 相對(duì)飽和[20]。因此，N沉降的增加對(duì)微生物及其群落結(jié)構(gòu)的影響及其機(jī)制可能與溫帶不同。

有關(guān)亞熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)對(duì)N 沉降的響應(yīng)已有許多研究，但這些研究主要集中在亞熱帶人工林中[21-22]，而針對(duì)亞熱帶頂級(jí)群落的常綠闊葉天然林的相關(guān)研究仍較少[8]。我國亞熱帶地區(qū)生物多樣性高、生產(chǎn)力高，是我國重要的森林碳匯基地，而米櫧(Castanopsis carlesii(Hemsl.) Hayata.)是本區(qū)域地帶性頂級(jí)群落主要樹種之一。本研究通過野外模擬不同N 沉降水平，探討土壤有機(jī)碳含量和可溶性有機(jī)碳以及微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，以便能夠更準(zhǔn)確地理解N 沉降對(duì)亞熱帶常綠闊葉林生態(tài)系統(tǒng)碳匯功能的影響，為預(yù)測未來森林生態(tài)系統(tǒng)對(duì)全球變化的響應(yīng)與適應(yīng)提供實(shí)地觀測數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于福建省三明市格氏栲自然保護(hù)區(qū)（26°11′ N，117°28′ E）的米櫧天然常綠闊葉林（約200 年無人為干擾），海拔315 m。該區(qū)域?qū)儆趤啛釒Ъ撅L(fēng)氣候，夏季高溫多雨，冬季低溫少雨，年均氣溫19.4℃，年均降水量1 700 mm（多集中于3—8 月）。植物群落種類豐富且層次分明，其中，喬木主要有米櫧、木荷（Schima superbaGardner et Champ.）、馬尾松（Pinus massonianaLamb.）、虎皮楠（Daphniphyllum oldhamii(Hemsl.)K. Rosenthal）等，且米櫧為優(yōu)勢(shì)種。土壤類型為砂巖發(fā)育的山地紅壤，土壤容重為1.12 g·cm-3，土壤全碳、全氮、全磷和全鉀含量分別為24.5、1.86、0.21、2.9 g·kg-1。2011 年調(diào)查林分時(shí)，林分密度為1 955 株·hm-2，郁閉為0.89 度，樹高為11.9 m。

2 研究方法

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2011 年6 月，在米櫧天然林內(nèi)設(shè)置12 個(gè)20 m ×20 m 樣地，相鄰2 個(gè)樣地間隔10 m 作為緩沖區(qū)。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置對(duì)照（CK，0 kg·hm-2·a-1）、低氮（LN，40 kg·hm-2·a-1）、高氮（HN，80 kg·hm·a）3 種處理（2011 年N 沉降 背 景 值36 kg·hm-2·a-1），每 處 理4 個(gè) 重 復(fù)，N 沉降量分每月等量（全年分12 次）噴灑至相應(yīng)樣地。每月月初將硝酸銨（NH4NO3）溶于20 L 蒸餾水，利用噴霧器均勻噴灑至相應(yīng)樣方內(nèi)，對(duì)照處理噴灑等量蒸餾水，減少因外加水造成的森林生物地球化學(xué)循環(huán)的影響。N 沉降于2012 年10 月開始實(shí)施。

2.2 土壤采集與處理

2016 年7 月，利用直徑2 cm 土鉆在各處理樣地中采集0～10、10～20 cm 土樣。在每個(gè)樣地內(nèi)選擇10 個(gè)點(diǎn)采集土壤樣品混合成一個(gè)樣品，放在冰袋中立即帶回實(shí)驗(yàn)室。然后，去除動(dòng)植物殘?bào)w、小石子等雜質(zhì)并過2 mm 篩。樣品分為2 部分，一部分-20℃冷藏用于分析土壤微生物生物量，另一部分風(fēng)干用于土壤理化性質(zhì)的分析。

2.3 土壤理化性質(zhì)及微生物測定

土壤總有機(jī)碳（SOC）、總氮（TN）使用元素分析儀直接測定（Elementar Analyzer Vario EL IV，德國）。用去離子水按照水土比4:1 提取土壤可溶性有機(jī)碳（DOC），混合液放入震蕩儀震蕩30 min（7 g），然后放入高速離心機(jī)內(nèi)離心15 min（1 370 g），最后提取上層清液并過0.45 μm 濾膜，濾液利用總有機(jī)碳分析儀（TOC-VCPH/CPN，Shimaszu，日本）測定DOC 含量。土壤硝態(tài)氮（NO3--N）、銨態(tài)氮（NH4+-N）使用氯化鉀（KCl）按水土比4:1 提取，采用連續(xù)流動(dòng)分析儀（Skalar san++，荷蘭）測定。土壤pH 值使用去離子水按水土比2.5:1 提取，攪拌后靜置等溶液澄清后，采用玻璃電極測定（STARTER 300，OHAUS，美國）。

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)采用磷脂脂肪酸（PLFAs）法測定[16]，稱4 g 鮮土，經(jīng)過脂類抽提、脂類分離、甲脂化后，所得溶液采用氣相色譜儀（Agilent 6890 N，美國）測定，同時(shí)結(jié)合MIDI微生物識(shí)別系統(tǒng)（MIDI, Inc., New-ark，DE），根據(jù)各脂肪酸組分峰值保留時(shí)間確定微生物種類，微生物PLFA 表征[23]見表1。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)（Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)），有必要時(shí)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。對(duì)不同處理之間土壤基本理化性質(zhì)和各類微生物生物量的差異顯著性進(jìn)行多重比較（LSD 檢驗(yàn)）。運(yùn)用混合線性模型評(píng)估N 沉降和土層對(duì)土壤基本理化性質(zhì)和各類微生物生物量的影響，N 處理和土層作為固定因子，區(qū)組作為隨機(jī)因子，顯著性水平設(shè)定為p＜ 0.05，混合線性模型采用R 包nlme。用Pearson 相關(guān)系數(shù)分析在N 沉降水平下不同土層土壤理化性質(zhì)和各類微生物生物量及總微生物生物量的相關(guān)性；采用主成分分析（PCA）法分析微生物群落結(jié)構(gòu)差異性；采用隨機(jī)森林模型計(jì)算土壤理化性質(zhì)和微生物對(duì)土壤有機(jī)碳影響的相對(duì)重要性，使用R 包RandomForest 進(jìn)行隨機(jī)森林計(jì)算，利用R 包rfPermute 檢測各影響因素重要性的p值。所有統(tǒng)計(jì)分析均在R (R.3.6.1)軟件中完成。

表1 表征微生物的PLFAsTable 1 PLFAs characterizing microbes

3 結(jié)果與分析

3.1 N 沉降對(duì)土壤基本理化性質(zhì)的影響

0～10 cm 土層中，與CK 相比，LN 處理顯著提高了SOC、TN、NO3--N、DOC 含量和C/N，而土壤pH 值和NH4+-N 含量無顯著變化；HN 處理土壤pH 值顯著增加，NO3--N 含量增加約1 倍，而對(duì)SOC、TN、DOC、NH4+-N 含量和C/N 比無顯著影響（表2）。

表2 不同施氮處理下不同土層土壤基本理化性質(zhì)的變化Table 2 Changes of soil properties under different nitrogen level addition treatments in different layer

10～20 cm 土層中，與CK 相比，LN 處理土壤pH 值顯著降低，而其他理化性質(zhì)均無顯著變化；HN 處理后土壤NH4+-N 含量顯著增加，而pH 值和DOC 含量顯著降低，其他理化性質(zhì)無顯著變化（表2）。

混合線性模型分析結(jié)果（表2）表明：N 沉降對(duì)SOC、DOC、NO3--N 和pH 均有顯著影響，而土層對(duì)各個(gè)土壤理化性質(zhì)參數(shù)均有顯著影響；此外，NO3--N 和pH 受N 沉降和土層交互作用的影響，而對(duì)其它理化性質(zhì)不存在交互作用。

3.2 N 沉降對(duì)土壤微生物總磷脂脂肪酸（PLFAs）含量及群落結(jié)構(gòu)的影響

圖1 表明：0～10、10～20 cm 土層中，不同N 沉降水平處理下，土壤細(xì)菌PLFAs 含量顯著大于真菌和放線菌PLFAs 含量。不同N 沉降水平對(duì)同一土層中不同類群微生物PLFAs 含量的影響不同；同時(shí)，土層深度也是影響各類群微生物PLFAs含量的一個(gè)重要因素。

圖1 不同施氮處理下不同土層土壤微生物PLFAs 含量Fig. 1 PLFAs concentration of soil microbial groups in different N level addition treatments in different layer

0～10 cm 土層中，與CK 相比，LN 處理的總PLFAs 以及革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、叢枝菌根真菌、放線菌、真菌和細(xì)菌的PLFAs 含量分別增加25.4%、27.5%、24.9%、29.1%、26.3%、22.4%、26.2%，而對(duì)GP/GN 和F/B無顯著影響，HN 處理與LN 處理的結(jié)果類似(圖1）。10～20 cm 土層中，與CK 相比，LN 處理革蘭氏陽性菌的PLFAs含量降低18.3%，而對(duì)其它微生物類群、GP/GN和F/B 均無顯著影響，HN 處理對(duì)各類微生物及總PLFAs 含量均無顯著影響(圖1)。

3.3 微生物群落結(jié)構(gòu)及土壤有機(jī)碳變化的影響因子分析

主成分分析結(jié)果（圖2）表明：前2 個(gè)主成分解釋了微生物群落結(jié)構(gòu)的84.9%，其中，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）的解釋度分別為74.9%和10.0%。N 沉降顯著影響0～10 cm 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，而對(duì)10～20 cm 土層土壤微生物群落結(jié)構(gòu)無影響。此外，0～10、10～20 cm 土層間土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著，并且與是否N 沉降處理無關(guān)。

圖2 不同施氮處理下土壤微生物PLFAs 主成分分析Fig. 2 Principal component analysis of PLFAs composition of microbial community under different nitrogen level addition treatments

Person 相關(guān)性分析（表3）發(fā)現(xiàn)：在0～10 cm土層中，除革蘭氏陽性菌外，其余各類微生物類型及總PLFAs含量與SOC、TN 呈顯著或極顯著正相關(guān)；土壤DOC 與除放線菌外的其他各類微生物類型的PLFAs 含量均呈顯著正相關(guān)；土壤真菌PLFAs含量與C/N 呈顯著正相關(guān)。與0～10 cm 相比，10～20 cm 土層中各菌群PLFAs 含量與氨氮、硝氮、SOC、TN、pH 以及DOC 含量無明顯相關(guān)性。

表3 土壤微生物PLFAs 含量與土壤理化指標(biāo)相關(guān)性分析Table 3 Correlations between soil PLFA content and soil physical and chemical indicators

隨機(jī)森林模型結(jié)果（圖3）表明：DOC、TN、C/N、總PLFAs、細(xì)菌、叢枝菌根真菌和放線菌是驅(qū)動(dòng)SOC 變化的主要因素，隨機(jī)森林模型能解釋SOC 變化的93%（p＜ 0.001）。

圖3 影響土壤有機(jī)碳（SOC）含量變化因子的相對(duì)貢獻(xiàn)Fig. 3 The relative contributions of driving factors on SOC

4 討論

4.1 N 沉降對(duì)土壤有機(jī)碳的影響

本研究結(jié)果表明，與CK 處理相比，LN 處理表層（0～10 cm）土壤有機(jī)碳含量增加27.4%，而HN 處理對(duì)土壤有機(jī)碳含量無顯著影響（表2），這與其它野外觀測和模型預(yù)測結(jié)果類似[9,11,24]。Frey 等[11]對(duì)哈佛森林長達(dá)20 a N 沉降研究表明，N 沉降使土壤有機(jī)質(zhì)層有機(jī)碳含量增加高達(dá)80%，其主要由于N 沉降能降低土壤微生物生物量、活性和改變土壤有機(jī)質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而降低對(duì)土壤有機(jī)碳的礦化作用[6,8]，但此機(jī)制并不能解釋本研究的結(jié)果，本研究中土壤微生物生物量并沒有降低反而增加（圖2）。本研究中，N 沉降導(dǎo)致SOC 含量增加的可能原因如下：第一，0～10 cm 土層中，LN 處理土壤DOC 含量比CK 增加51%（表2），DOC 含量的增加為微生物提供了大量的碳源，促進(jìn)了微生物的生長和繁殖（圖1）；隨機(jī)森林模型結(jié)果表明，DOC 含量與土壤中的細(xì)菌、真菌、放線菌的PLFAs 和總PLFAs 是影響SOC 最重要的因素（圖3），這些因素可以解釋SOC 變化的93%（圖3）。第二，SOC 與土壤微生物總PLFAs 及其各組分呈顯著的正相關(guān)（表3）；同時(shí)，本試驗(yàn)地之前的研究結(jié)果表明，LN 沉降增加微生物生物量，同時(shí)提高了土壤微生物的呼吸[25]，土壤微生物的周轉(zhuǎn)加快，而HN 處理剛好相反；微生物周轉(zhuǎn)加快產(chǎn)生大量的微生物殘?bào)w碳，而微生物殘?bào)w碳是土壤有機(jī)碳的重要來源之一[26]，LN 沉降增加了0～10 cm 土壤氨基糖含量[27]，這也可能是本研究中土壤有機(jī)碳含量增加的重要因素之一。第三，細(xì)根是土壤有機(jī)碳的重要來源之一，前期相關(guān)研究結(jié)果表明，LN 處理顯著提高了0～10 cm 細(xì)根生物量，而HN 處理無顯著影響[28]，而大量的細(xì)根輸入也可能是導(dǎo)致LN 處理土壤有機(jī)碳含量增加的主要因素之一。綜上所述，本研究中，LN 處理增加了土壤DOC 含量、細(xì)根生物量、土壤微生物生物量并加速了微生物周轉(zhuǎn)，這些因素共同作用進(jìn)而使LN 處理土壤有機(jī)碳含量顯著增加，但HN 處理對(duì)這些因子的影響不顯著，導(dǎo)致土壤有機(jī)碳含量未發(fā)生改變。此外，本研究中，LN 沉降短期內(nèi)（4 a）0～10 cm 土壤有機(jī)碳含量比CK 增加了27.4%，其累積速率比溫帶地區(qū)快，這可能與亞熱帶地區(qū)土壤生物化學(xué)循環(huán)速率較快有關(guān)，但其驅(qū)動(dòng)機(jī)制是什么？而不同劑量N 沉降對(duì)土壤有機(jī)碳的影響是否具有長期效應(yīng)？這些問題仍有待于進(jìn)一步的研究。

4.2 N 沉降對(duì)土壤微生物生物量及群落結(jié)構(gòu)的影響

本研究結(jié)果表明，N 沉降顯著增加了0～10 cm土層土壤總PLFAs 及其各微生物類群的PLFAs，而對(duì)10～20 cm 土層各類微生物PLFAs 無顯著影響（圖1）。本研究中，0～10 cm 土層中，LN 處理下土壤SOC、TN 和C/N 顯著大于CK（表2），且真菌PLFAs 含量和SOC 以及TN 相關(guān)性極顯著（表3）。研究表明，土壤真菌屬于異養(yǎng)型微生物，以土壤有機(jī)質(zhì)作為碳源進(jìn)行生存和繁殖[29-30]。因此，N 沉降顯著增加表層真菌含量（圖1）。細(xì)菌是土壤微生物中最活躍的組成部分，對(duì)有機(jī)質(zhì)分解起重要作用，而且細(xì)菌對(duì)易利用的碳源（如低分子量、低木質(zhì)素）響應(yīng)更加靈敏[18,25,29-30]。相關(guān)性分析表明，細(xì)菌PLFAs 含量與DOC、SOC 呈顯著正相關(guān)，表明N 沉降下土壤DOC、SOC 為細(xì)菌生物量增加提供了必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)。土壤放線菌能夠分解細(xì)菌以及真菌難分解的復(fù)雜結(jié)構(gòu)化合物[30]，本研究發(fā)現(xiàn)，LN 和HN 處理下，0～10 cm土層土壤放線菌含量分別比CK 處理增加26%和15%，表明N 沉降有利于放線菌生物量的增加。有研究表明，放線菌含量和土壤氮的有效性成正相關(guān)[31]，通過相關(guān)性發(fā)現(xiàn)放線菌和土壤TN 的含量成顯著正相關(guān)，說明N 沉降提高了土壤的TN 含量，進(jìn)而影響土壤放線菌含量。

N 沉降改變0～10 cm 土層土壤養(yǎng)分的有效性（如DOC、NH4+-N 和NO3--N 含量），進(jìn)而對(duì)0～10 cm 土層微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。有研究認(rèn)為，pH 是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素[12-13,18]，雖然本研究中N 沉降改變了土壤pH 值（表2），但相關(guān)性表明土壤pH 和各個(gè)菌群PLFAs 含量之間相關(guān)不顯著（表3）。因此，本研究中，土壤pH 值不是導(dǎo)致微生物菌群落結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵因子。Wan 等[32]對(duì)亞熱帶杉木人工林和米老排人工林研究表明，土壤C/N 是驅(qū)動(dòng)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因子，本研究中，LN 處理顯著提高土壤C/N 比（表2），C/N 比增加有利于微生物對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收[18,30,32]，進(jìn)而導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。此外，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化與氮沉降水平有關(guān)，研究表明，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)添加N 的響應(yīng)是非線性的，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的潛在變化發(fā)生在氮添加水平為16～32 g·m-2·a-1[33]。本研究中，氮沉降水平分別為40、80 kg·hm-2·a-1，已超過其閾值，這也可能是引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主要原因之一。

5 結(jié)論

通過連續(xù)4 a N 沉降處理對(duì)SOC 和微生物群落結(jié)構(gòu)研究結(jié)果表明，LN 處理有利于0～10 cm 土層土壤有機(jī)碳的積累，而HN 對(duì)SOC 無顯著影響；N 沉降主要通過增加土壤DOC、TN、C/N 和各類微生物生物量，加速土壤微生物的周轉(zhuǎn)，進(jìn)而增加SOC 的積累。此外，N 沉降提高了0～10 cm土壤養(yǎng)分有效性（如DOC 和TN 含量），進(jìn)而改變了微生物的群落結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果表明，在短期內(nèi)（＜ 5 a）的低水平N 沉降有利于亞熱帶地區(qū)常綠闊葉天然林土壤碳的積累。