周游 上海市醫(yī)療器械化妝品審評核查中心 （上海 200020）

內(nèi)容提要： 對臨床實(shí)驗(yàn)室檢測的干擾會(huì)造成檢測結(jié)果的不一致，從而對患者造成困惑和傷害。實(shí)驗(yàn)室通常無法輕易檢測到由干擾引起的誤差。為了避免這個(gè)問題，制造商應(yīng)在產(chǎn)品設(shè)計(jì)階段進(jìn)行充分的干擾物質(zhì)研究。常見的干擾包括血紅蛋白、膽紅素和脂質(zhì)、類風(fēng)濕因子、生物素等。文章對常見干擾物質(zhì)的干擾機(jī)制進(jìn)行總結(jié)，并結(jié)合審評經(jīng)驗(yàn)，剖析干擾物質(zhì)的研究關(guān)注點(diǎn)，供相關(guān)從業(yè)人員進(jìn)行參考。

在體外診斷試劑的分析系統(tǒng)中，一個(gè)物質(zhì)錯(cuò)誤地引起示值的增加或減少而改變檢測結(jié)果，這個(gè)物質(zhì)被稱為干擾物質(zhì)。干擾物質(zhì)可能會(huì)引起臨床診斷及治療的錯(cuò)誤，對患者產(chǎn)生不利的結(jié)局。雖然臨床實(shí)驗(yàn)室通過內(nèi)部質(zhì)量控制和外部質(zhì)量評估程序可以對結(jié)果進(jìn)行檢查，但通常不容易檢測到干擾引起的錯(cuò)誤。因此，體外診斷試劑廠商應(yīng)對干擾進(jìn)行充分的重視和研究，提升分析系統(tǒng)的特異性。本文旨在討論常見的干擾物質(zhì)類型以及可能導(dǎo)致的體外分析干擾機(jī)制，結(jié)合相關(guān)審評經(jīng)驗(yàn)，闡述干擾物質(zhì)研究要點(diǎn)及常見問題，為研發(fā)與注冊申報(bào)人員提供參考。

1.臨床上常見的干擾物質(zhì)及干擾機(jī)制

干擾分為內(nèi)因干擾和外因干擾。內(nèi)源性干擾來自患者自身樣本中存在的物質(zhì)，如溶血（血紅蛋白等物質(zhì)）、膽紅素、脂類、蛋白質(zhì)、抗體等。外源性干擾是指被引入患者樣本的物質(zhì)（如常用藥物、其代謝物或藥物制劑中的添加劑等）、患者攝入的物質(zhì)（如酒精、營養(yǎng)添加劑等）、以及樣本采集、運(yùn)輸、處理過程中引入的干擾，如溶血、防腐劑、抗凝劑等。還應(yīng)該考慮到文獻(xiàn)上已經(jīng)報(bào)道過的干擾同類試劑或者測量程序的物質(zhì)。申請人應(yīng)當(dāng)結(jié)合產(chǎn)品特點(diǎn)，篩選出可能干擾物質(zhì)予以研究。

1.1 溶血

溶血?dú)v來被認(rèn)為是影響生化結(jié)果的最常見的分析前錯(cuò)誤。溶血是由紅細(xì)胞膜的破壞引起的。紅細(xì)胞脆性較大，對切向應(yīng)力敏感。據(jù)研究表明，在特定人群，如糖尿病、多發(fā)性硬化癥和絕經(jīng)后女性中，紅細(xì)胞的機(jī)械脆性增加[1]。兩種主要的溶血類型包括體內(nèi)溶血和體外溶血。體內(nèi)溶血可能由于手術(shù)或藥物原因?qū)е?，體外溶血多由物理因素（機(jī)械性破壞、冷凍）引起。在體外溶血中，由于不當(dāng)操作，如針頭過小導(dǎo)致紅細(xì)胞通過針尖時(shí)被破壞、抗凝時(shí)用試管搖晃太劇烈、標(biāo)本存放溫度不合適或在運(yùn)輸過程中處理不當(dāng)導(dǎo)致紅細(xì)胞被破壞。

溶血可能通過多種機(jī)制干擾生物化學(xué)結(jié)果。主要分為改變樣品中分析物濃度和干擾分析物測量兩種途徑。①由于許多物質(zhì)在紅細(xì)胞內(nèi)外存在較大濃度差，因此紅細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物的釋放會(huì)改變測定結(jié)果。一些紅細(xì)胞內(nèi)本身包含的高濃度物質(zhì)，如血紅蛋白、鎂、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶等物質(zhì)會(huì)使測值升高，而紅細(xì)胞內(nèi)濃度較低的物質(zhì)，檢測結(jié)果會(huì)由于細(xì)胞內(nèi)液的稀釋作用而錯(cuò)誤降低。②氧合和脫氧血紅蛋白的吸光度光譜略有不同，但在415nm附近顯示最大吸光度，在320～450nm和540～580nm有較為顯著吸光度[2]。因此，在這些范圍內(nèi)使用基于吸光度測量的比色測定法更容易受到干擾。③溶血也可能引起與分析反應(yīng)的酶的釋放。例如，腺苷酸環(huán)化酶對肌酸激酶測定產(chǎn)生干擾[3]。除此之外，溶血引起的負(fù)干擾和正干擾相互作用也可能形成綜合干擾。

1.2 膽紅素

膽紅素存在于人類膽汁中的主要色素，呈棕黃色。膽紅素在生物體內(nèi)起著重要的生理作用，并且與多種生物過程密切相關(guān)。一般膽紅素的升高多由肝臟疾病引起。膽紅素吸收的光在400～540nm，峰值在460nm左右，在這些波長處進(jìn)行初級或次級吸光度測量的比色測定可能會(huì)受到一定影響[4]。膽紅素的抗氧化特性使其能夠與過氧化氫反應(yīng)，這是黃疸干擾的另一種機(jī)制。過氧化氫是一些常見化學(xué)檢測（包括膽固醇、甘油三酯、尿酸和酶促肌酐）的中間產(chǎn)物，因此容易受到黃疸干擾[5,6]。

1.3 高血脂癥

高脂血癥是一種病理狀態(tài)，其特征是患者血漿中至少有一種脂質(zhì)成分高于正常范圍，這通常是由于患者的脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)或代謝功能出現(xiàn)異常所引發(fā)的。在這種情況下，乳糜血的出現(xiàn)頻率增加，其表現(xiàn)形式為血漿呈乳白色或渾濁，血液中的脂肪含量顯著增加。

乳糜顆粒是乳糜血中的主要成分，主要由脂蛋白、膽固醇和三酰甘油構(gòu)成。這些顆粒的存在會(huì)對血液檢測產(chǎn)生一定的干擾作用，主要包括以下幾個(gè)方面：首先，乳糜顆粒會(huì)導(dǎo)致光散射，從而產(chǎn)生測量誤差；其次，乳糜顆粒的存在會(huì)占據(jù)一定的體積，體積減少導(dǎo)致水相減少；最后，脂肪顆粒會(huì)大量吸附在紅血球上，不僅使溶血速度降低，而且對紅血球的實(shí)際數(shù)量下降、白血球增多等紅血球的檢查結(jié)果也會(huì)產(chǎn)生影響[7]。

1.4 類風(fēng)濕因子

類風(fēng)濕因子（Rheumatoid Factor，RF）是一種在臨床上常見的自身抗體，是內(nèi)源性人抗體結(jié)合人γ球蛋白。RFs表現(xiàn)出對聚集的γ球蛋白的優(yōu)先結(jié)合，并參與免疫復(fù)合物的清除機(jī)制。然而，類風(fēng)濕因子在檢測過程中可能對一些檢查系統(tǒng)產(chǎn)生干擾，造成檢測結(jié)果的不正確。

RF主要是針對IGG Fc區(qū)的天然抗體。在標(biāo)準(zhǔn)的雙位點(diǎn)夾心免疫分析中，RF的干擾可能是正向或負(fù)向的。當(dāng)RF與捕獲抗體結(jié)合時(shí)，會(huì)形成空間位阻，可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的抑制結(jié)果。當(dāng)RF結(jié)合檢測抗體時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的升高結(jié)果。因此，在進(jìn)行類風(fēng)濕因子檢測時(shí)，需要考慮到這種干擾因素，并采取相應(yīng)的措施來消除或減小這種干擾，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[8]。

1.5 生物素

生物素與鏈親和素之間的相互作用是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)與配體之間最強(qiáng)烈的非共價(jià)結(jié)合之一，這種結(jié)合具有快速形成、耐受極端溫度、pH值和變性劑的特性。其鍵結(jié)形成迅速，耐極端溫度、pH值和變性劑。因此，生物素-鏈霉親和素偶聯(lián)是體外診斷測試的常見組成部分，有助于檢測和靶向生物分析物。然而，血液中高生物素含量會(huì)導(dǎo)致檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。飲食生物素?cái)z入通常不會(huì)導(dǎo)致血液生物素濃度超過體外診斷試驗(yàn)的干擾閾值。然而，最近大劑量生物素補(bǔ)充劑的趨勢出現(xiàn)了對免疫測定的干擾現(xiàn)象。所有基于生物素的免疫分析都容易受到生物素的干擾。根據(jù)生物素劑量、試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)干擾閾值的不同，生物素干擾可能導(dǎo)致假低（夾心免疫測定）或假高（競爭性免疫測定）結(jié)果[9,10]。

2.干擾物質(zhì)的研究關(guān)注點(diǎn)

以審評經(jīng)驗(yàn)來看，申報(bào)資料干擾試驗(yàn)大多缺乏科學(xué)性。常見的問題有：試驗(yàn)條件無法覆蓋說明書聲稱內(nèi)容，分析物濃度未包含醫(yī)學(xué)決定水平或參考區(qū)間上/下限附近、干擾物濃度選擇不合理或添加方式不合理等。

有關(guān)干擾試驗(yàn)的試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)有：中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WST 416-2013《干擾實(shí)驗(yàn)指南》、CLSI發(fā)布的《EP7-A2:Interferencetestinginclinicalchemistry;approved guideline-secondedition》《定量檢測體外診斷試劑分析性能評估注冊審查指導(dǎo)原則》等?？刹捎锰砑痈蓴_物質(zhì)的樣本進(jìn)行研究方法，或者通過申報(bào)試劑和不受該干擾物影響的測量程序檢驗(yàn)結(jié)果間的比對有代表性的患者樣本，進(jìn)行干擾物質(zhì)研究。

2.1 添加干擾物質(zhì)的研究

干擾試驗(yàn)一般可采用配對比對的方式，即采用添加干擾物質(zhì)的樣本進(jìn)行研究（添加的干擾物體積應(yīng)不影響反應(yīng)體系的整體基質(zhì)），比較干擾樣本和不包含或含正常濃度水平干擾物樣本檢測結(jié)果間差異。如果差異超出接受范圍，再進(jìn)一步研究該干擾物質(zhì)的濃度水平。

在干擾物的篩選過程中，需要根據(jù)產(chǎn)品的具體特性進(jìn)行深入的分析和選擇。包括：在病理?xiàng)l件下產(chǎn)生的代謝物，在患者治療過程中引入的化合物（如藥物、血漿擴(kuò)張劑和抗凝血?jiǎng)?、患者攝入的物質(zhì)，在標(biāo)本制備過程中添加的物質(zhì)等。在進(jìn)行試驗(yàn)之前，必須確保試驗(yàn)的客觀性。研究人員需要根據(jù)分析物的醫(yī)療用途來設(shè)定干擾物的總允許誤差，以此來判斷一定濃度的干擾物是否可以被接受。這個(gè)總允許誤差可以參考我國國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心臨床檢驗(yàn)室間質(zhì)量評價(jià)計(jì)劃中的相關(guān)規(guī)定，或者根據(jù)臨床專家的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)過廣泛的討論，制定相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)。此外，也可以根據(jù)生物學(xué)變異或分析變異來確定總允許誤差。

在分析物試驗(yàn)濃度的選擇上，建議使用至少兩個(gè)分析物水平的樣本，這些濃度應(yīng)在醫(yī)學(xué)決定水平或參考區(qū)間的上下限附近。當(dāng)需要明確干擾物質(zhì)濃度與干擾程度之間的關(guān)系時(shí)，往往需要納入更多分析物濃度的樣本。對于干擾物試驗(yàn)濃度來說，常見可能內(nèi)源性干擾物的建議試驗(yàn)濃度可參考《干擾實(shí)驗(yàn)指南》附錄C或CLSI-EP7-A2文件附錄D（appendixD.InterferenceTestConcentrationsforEndogenous Analytes）。內(nèi)源性干擾物一般為目標(biāo)人群中預(yù)期的最高濃度。在確定檢測次數(shù)的過程中，需要綜合考慮多個(gè)因素，包括被評估方法的批內(nèi)重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差、試驗(yàn)濃度下的干擾標(biāo)準(zhǔn)以及置信水平等。通過運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行計(jì)算，以最終確定合適的檢測次數(shù)。

在數(shù)據(jù)處理與分析中，可通過試驗(yàn)樣本與對照樣本的偏差標(biāo)識干擾結(jié)果dobs，然后根據(jù)無效假設(shè)值（dnull，通常為0）、對雙邊檢驗(yàn)100(1-α)%置信水平時(shí)正態(tài)分布的百分?jǐn)?shù)（z(1-α/2)）、被評價(jià)方法的批內(nèi)重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差s以及樣本重復(fù)次數(shù)n來計(jì)算界值dc。見公式（1）～（3）。

其中：t0.975,n-1是自由度為n-1,t分布97.5%的概率密度值。

根據(jù)計(jì)算結(jié)果，如果dobs≤dc，那么可以認(rèn)為在當(dāng)前濃度下，該物質(zhì)并未對評價(jià)產(chǎn)生明顯的干擾作用。然而，如果dobs＞dc，那么就應(yīng)當(dāng)認(rèn)為在當(dāng)前濃度下，該物質(zhì)存在顯著的干擾影響。

2.2 使用患者標(biāo)本評估干擾

在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，還可以基于兩組患者標(biāo)本（檢測組和對照組）進(jìn)行分析，這兩組標(biāo)本應(yīng)分別使用被評估的檢測方法、參考檢測方法或其他合格的對比檢測方法進(jìn)行比較。在此過程中，已知對干擾敏感度較低的參考檢測方法被用來在對比研究中建立“真值”。為了保證試驗(yàn)的可靠性，檢測標(biāo)本應(yīng)來源于具有特定疾病、服用特定藥物或其他已知組成成分的目的患者群體。而對照組樣本則應(yīng)來自無相關(guān)疾病、未服用相關(guān)藥劑的人群，且其待分析物的分布應(yīng)與檢測標(biāo)本基本一致。

在數(shù)據(jù)分析階段，應(yīng)主要判斷對比檢測方法中由干擾引起的差異是否顯著，以及干擾形成偏差的方向。然而，需要注意的是，利用患者標(biāo)本評估干擾的方法僅能建立干擾與偏差之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，而不能確定干擾物的具體來源。真實(shí)的干擾物可能是恰巧與疑似干擾物同時(shí)存在的物質(zhì)。比如，由于疾病產(chǎn)生的生化代謝物引起的干擾可能會(huì)被錯(cuò)誤地歸結(jié)為用于治療疾病的藥物。

3.小結(jié)與展望

隨著新療法的發(fā)展，新的干擾物質(zhì)也不斷出現(xiàn)。隨著越來越多的檢測方法被開發(fā)出來，更多的物質(zhì)也可以被檢測。在降低試劑的干擾方面，醫(yī)療器械廠商需要深入和專業(yè)的調(diào)查，可在檢測設(shè)計(jì)、抗體的結(jié)構(gòu)和特異性以及信號產(chǎn)生和檢測方面進(jìn)行改進(jìn)，以提升試劑的抗干擾性能。