范行良 趙子希 陳亮 中國食品藥品檢定研究院 （北京 102629）

內(nèi)容提要： 膠原蛋白結(jié)構(gòu)是其功能特性的基礎(chǔ)，而膠原蛋白自組裝過程是結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通過紫外-可見光、濁度法、熒光分度法、紅外光譜、圓二色光譜術(shù)和核磁共振波譜法等方法可對膠原蛋白自組裝過程進行監(jiān)測和評價，并可用于建立膠原蛋白類醫(yī)療產(chǎn)品質(zhì)量控制和評價有效方法。

膠原蛋白是細胞外基質(zhì)中重要的結(jié)構(gòu)蛋白，不同組織中分布的不同類型膠原蛋白具有獨特功能[1]。例如，Ⅰ型膠原蛋白主要分布于皮膚中，主要功能之一是為組織提供機械支撐以確保其完整性和彈性，通過膠原纖維提供抗拉強度來防止撕裂并保持彈性。膠原蛋白類醫(yī)療產(chǎn)品預(yù)期利用膠原蛋白的各種功能特性，除機械支持外，膠原蛋白還積極參與細胞-基質(zhì)相互作用，并影響諸如細胞黏附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、組織穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、血管生成以及纖維化和疤痕等方面的細胞行為。而膠原蛋白結(jié)構(gòu)是其功能特性的基礎(chǔ)，因此，對膠原蛋白結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵自組裝過程及其相關(guān)表征方法進行研究可作為組織提取膠原蛋白質(zhì)量控制和評價關(guān)鍵指標，對重組膠原蛋白也可作為蛋白設(shè)計和性能驗證的重要方法。本文概述了可用于膠原蛋白自組裝表征的光譜檢測方法進展。

1.膠原蛋白的結(jié)構(gòu)

膠原蛋白各級結(jié)構(gòu)的自組裝形成過程，包括α-螺旋、三螺旋以及更為典型的自組裝形成的膠原原纖維，決定了膠原蛋白的結(jié)構(gòu)功能。膠原蛋白α-肽鏈由氨基酸殘基組成線性鏈，其自組裝通過氫鍵、范德華力和疏水相互作用在鏈兩側(cè)氨基酸殘基間發(fā)生，從而穩(wěn)定α-螺旋結(jié)構(gòu)，并由三條α-肽鏈互相纏繞形成右手螺旋結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，三股螺旋的膠原分子通過側(cè)連，自組裝形成有序排列的直徑約50～200nm的膠原原纖維，并進一步形成膠原纖維。

2.生理狀態(tài)下的膠原蛋白自組裝過程

為了發(fā)揮其功能，構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸鏈必須以特定方式排列，這被稱為蛋白質(zhì)自組裝。自組裝是通過位于鏈兩側(cè)的氨基酸殘基之間的化學(xué)吸引力而發(fā)生的。這些化學(xué)鍵將蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，并提供整體結(jié)構(gòu)所需的穩(wěn)定性。膠原蛋白由長線性氨基酸鏈組成，在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中首先合成前膠原鏈，其中包含多個Gly-Pro-Hyp重復(fù)序列形成長線狀結(jié)構(gòu)。然后進行賴氨酸和羥脯氨酸殘基的羥基化修飾，這些修飾對于三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定至關(guān)重要。隨著前膠原分子裂解為單體-原膠原，原膠原分子會自發(fā)地折疊成三螺旋結(jié)構(gòu)，并進一步聚合形成纖維最終形成膠原纖維。同時，單體也會橫向聚集生成纖絲。整個自組裝過程可以分為靜滯期（核心期）、生長期（快速增長期）和平衡期（平臺期）等三個階段[2]。自組裝過程是形成復(fù)雜膠原基質(zhì)不可或缺的核心過程，在支撐人體各種組織完整性和功能方面起到關(guān)鍵作用。

3.膠原蛋白自組裝的表征

表征膠原蛋白自組裝是一個復(fù)雜的多維過程，涉及研究膠原蛋白分子在組織成高階結(jié)構(gòu)時的分子、結(jié)構(gòu)、機械和生物特性。膠原蛋白是各種組織細胞外基質(zhì)中含量最高的蛋白質(zhì)，在提供結(jié)構(gòu)完整性、機械強度和組織支撐方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。了解膠原蛋白的自組裝對揭示其在組織發(fā)育、維護和修復(fù)中的作用至關(guān)重要。光譜學(xué)表征是研究膠原蛋白自組裝的重要手段，包括紫外-可見光、濁度法、熒光分度法、紅外光譜、圓二色光譜術(shù)和核磁共振波譜法等。通過這些方法可以了解膠原蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)、氫鍵和分子相互作用，并監(jiān)測自組裝的過程。

3.1 紫外-可見光譜

紫外-可見光譜測量分子對紫外光和可見光的吸收，其特定波長可能因分子結(jié)構(gòu)而變化。雖然膠原蛋白本身沒有獨特的發(fā)色團，但其中某些氨基酸殘基可以促進在紫外-可見光范圍內(nèi)的吸光度。當光穿過樣品時，某些波長被樣品分子中的發(fā)色團（產(chǎn)生顏色的基團）吸收，導(dǎo)致吸光度發(fā)生變化。膠原蛋白自組裝會使發(fā)色團環(huán)境發(fā)生變化，從而影響其吸光度。因此，通過分子相互作用引起的吸光度變化來監(jiān)測膠原蛋白的自組裝是可行的。芳香族氨基酸色氨酸和酪氨酸是膠原中兩個重要的發(fā)色團，二者分別在280nm和275nm左右有最大吸收峰。然而，在膠原中這兩種氨基酸含量較少，所以膠原蛋白在200～240nm處具有最大吸收峰[3]。這與多肽鏈上C=O、-COOH和-CO-NH2基團有關(guān)[4]。M.Ramesh Kumar等[5]在研究電化學(xué)制造過程中膠原膜機械性能與聚集過程關(guān)系時，使用了紫外/可見光譜來觀察沉積后電解質(zhì)相對于純水的變化。結(jié)果顯示，在200nm（肽鍵）和300nm（芳香族氨基酸側(cè)鏈）附近寬峰強度隨著電合成時間增加而減小，表明更多膠原蛋白參與形成了膠原膜纖維。紫外/可見光譜法具有以下優(yōu)點：①高通量：可以快速分析多個樣品；②非破壞性：不會改變樣品；③易操作：儀器設(shè)置簡單且易于操作；④定量分析：提供了關(guān)于吸光度變化數(shù)量信息；⑤動力學(xué)監(jiān)測：適用于實時監(jiān)測自組裝過程。然而該方法也存在以下不足之處：①結(jié)構(gòu)信息受限：提供的分子結(jié)構(gòu)和相互作用信息有限；②靈敏度不足：可能不足以檢測細微的結(jié)構(gòu)變化；③蛋白質(zhì)聚集：可能受到蛋白質(zhì)聚集和散射的影響。此外，膠原蛋白在紫外-可見光范圍內(nèi)的吸光度受到多種因素的影響，包括色氨酸和酪氨酸殘基的數(shù)量、它們的局部環(huán)境以及其他分子的存在。這些吸收峰可用于監(jiān)測自組裝過程中膠原蛋白構(gòu)象和相互作用的變化，但確切的波長可能會根據(jù)具體樣品和條件而有所不同。

3.2 濁度法

濁度法是通過膠原蛋白溶液的濁度-時間曲線來反映自組裝的過程。凝膠蛋白肽自組裝時，溶液變化包括“溶液-濁液-凝膠”的三個過程[2]。在檢測波長方面，Mingyan Yan等[6]分別采用313nm和400nm波長研究狹鱈魚皮和羅非魚胃蛋白酶溶解型膠原蛋白自組裝[7]。曾泉[8]用分光光度法在313nm波長檢測膠原蛋白成纖維的動力學(xué)，說明不同樣品可以用不同波長來檢測自組裝。

濁度法受到的干擾因素較多。濃度是影響膠原蛋白自組裝的重要因素。狹鱈魚皮膠原蛋白自組裝的臨界濃度為0.3～0.6mg/mL，0.6mg/mL以上狹鱈魚皮膠原蛋白進行自組裝。0.6mg/mL濃度樣品靜滯期最長，2mg/mL濃度樣品靜滯期、生長期增長斜率和最大吸光度值均高于1mg/mL。由于吸光度值與膠原纖維的直徑正相關(guān)，膠原纖維直徑越大，吸光度越高，這提示只有在最適濃度條件下，膠原蛋白自組裝形成的膠原原纖維直徑最大。

pH對膠原蛋白具有重要的影響。在不同pH溶液中，膠原蛋白一些功能基團的電荷會發(fā)生改變，從而影響膠原蛋白自組裝。在pH7.0～7.6范圍內(nèi)，狹鱈魚皮膠原蛋白可以形成自組裝，而且在接近等電點的pH7.2時，形成的膠原纖維直徑最大，而在pH 7.0以下不發(fā)生自組裝。

離子強度對膠原蛋白自組裝的影響也存在最適范圍，狹鱈魚皮膠原蛋白在30～60mmol/L最適合自組裝，而羅非魚的胃蛋白酶溶膠原蛋白在65～97.5mmol/L范圍生長期增長斜率最大。

在不同的研究中，溫度對自組裝的影響不盡相同，大鼠鼠尾1型膠原在27°C、32°C和37°C表現(xiàn)為隨著溫度升高，靜滯期依次縮短，27°C的靜滯期最長[9]。而羅非魚胃蛋白酶溶解型膠原蛋白則是28°C靜滯期最短，28°C居中，37°C最長[3]。

濁度法的優(yōu)點是簡便易行，不足之處是無法獲得膠原聚集體的數(shù)量和大小，而且產(chǎn)生濁度的干擾因素較多，容易產(chǎn)生較大誤差[10]。

3.3 熒光光譜術(shù)

熒光光譜術(shù)是一種檢測膠原自組裝的有效方法，包括內(nèi)源熒光和熒光探針，該方法快速、簡便、準確，具有較高的靈敏度和選擇性?，F(xiàn)在用于膠原蛋白的熒光探針主要包括3甲氧基4’N,N二甲氨基黃酮（DMMF）、芘熒光探針和硫磺素T三種。

膠原蛋白中的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸殘基等芳香族氨基酸具有固有熒光，對于Ⅰ型膠原蛋白，膠原蛋白分子中苯丙氨酸和酪氨酸殘基之間的FRET變化可以揭示溶液中膠原蛋白分子相對位置的變化。Kun Wu等[11]將苯丙氨酸和酪氨酸殘基之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）作為內(nèi)源探針，與1,8-苯胺萘磺酸鹽外源探針進行了比對研究。結(jié)果表明，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移、熒光兩相圖和二維相關(guān)熒光光譜可以研究膠原在酸性溶液中的聚集。在0.30～0.45mg/mL范圍內(nèi)出現(xiàn)膠原蛋白聚集，而更復(fù)雜的膠原蛋白聚集在更高濃度的膠原蛋白（0.75和1.05mg/mL）下出現(xiàn)。通過對GdmCl誘導(dǎo)膠原蛋白進行的研究，這些聚集體通過脯氨酸的Ca或Cd原子與芳香族殘基之間的CH-p相互作用來維持穩(wěn)定，在二維相關(guān)熒光分析中出現(xiàn)298和316nm的峰[11]。劉煒熹等[2]將酪氨酸作為內(nèi)源熒光，以280nm為激發(fā)波長，290～500nm為發(fā)射波長，對烏鱧膠原蛋白肽的組裝過程進行檢測，結(jié)果表明，隨著離子強度的增加，膠原蛋白肽最大發(fā)射波長藍移12nm，說明酪氨酸在自組裝過程中逐漸被包裹遮蔽，導(dǎo)致最大熒光強度下降，可以通過熒光下降的程度來表征膠原蛋白自組裝的進程[2]。賈俊強等[13]在用超聲波對鯽魚皮膠原蛋白處理的過程中，發(fā)現(xiàn)隨著超聲功率的增大，膠原蛋白內(nèi)部的酪氨酸暴露出來，最大熒光強度的增強，進一步證實了內(nèi)源熒光用于自組裝過程檢測的可行性[3]。

DMMF是一種分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移化合物，對周圍介質(zhì)非常敏感，其熒光光譜可以根據(jù)周圍的溶液環(huán)境而改變。因此，DMMF可以作為熒光探針來檢測介質(zhì)的極性和周圍的微黏度，進而推斷溶液中大分子構(gòu)象的變化。膠原蛋白在380nm左右吸收接近于0。為了避免膠原蛋白自身發(fā)色團的干擾，Shi等[12]選擇380nm作為DMMF的激發(fā)光。在0.1mol/L醋酸溶液中，當豬皮膠原蛋白濃度＞0.5mg/mL時，膠原蛋白鏈中的酰胺基團與酸性溶液中的氫離子結(jié)合明顯增多，導(dǎo)致pH升高，分子內(nèi)和分子間氫鍵作用增強，疏水的DMMF更易進入弱極性區(qū)域。所以，DMMF熒光在465nm處有明顯升高，證明隨著濃度增大，膠原蛋白發(fā)生明顯的聚集。同樣膠原蛋白濃度的情況下，隨著pH的升高，DMMF熒光強度會進一步增強。

芘熒光探針是另一種研究膠原聚集行為的有力工具。在研究膠原蛋白聚集時，芘的激發(fā)波長為343nm，發(fā)射波長為360～500nm，將熒光探針I(yè)1/I3值穩(wěn)定時膠原蛋白濃度0.48g/L作為狹鱈魚皮膠原蛋白的臨界聚集質(zhì)量濃度[13]。

硫磺素T是苯并噻唑家族的一種熒光染料，可以特異性結(jié)合胃蛋白酶可溶性膠原蛋白，可用作研究膠原蛋白結(jié)構(gòu)的敏感工具。熒光探針硫磺素T的激發(fā)波長為430nm，發(fā)射波長為450～600nm。在膠原蛋白自組裝靜滯期，熒光探針硫磺素T在485nm波長的熒光強度隨著時間的延長而降低，因此更適合對膠原蛋白成核過程的監(jiān)控。由于檢測溫度為30°C，避免了溫度對硫磺素T熒光的影響[14]。

3.4 紅外光譜

紅外光譜可被用來分析紅外輻射與分子振動模式之間的相互作用。分子吸收與其振動模式相對應(yīng)的特征頻率的紅外輻射。膠原蛋白的酰胺鍵和側(cè)鏈基團具有不同的振動頻率，能夠識別二級結(jié)構(gòu)和分子相互作用，因此可用于探測膠原蛋白在自組裝過程中二級結(jié)構(gòu)的變化[15]。

膠原蛋白的傅里葉變換紅外光譜中酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ帶，與三螺旋密切相關(guān)結(jié)構(gòu)。小牛皮膚膠原蛋白酰胺A 譜帶的波數(shù)為3432cm-1，主要與N-H 伸縮振動有關(guān)。2979cm-1處的峰表示為與不對稱伸縮振動相關(guān)的酰胺B帶CH2。1640cm-1處的酰胺Ⅰ譜帶主要與C=O相關(guān)沿著多肽主鏈的伸縮振動；1560cm-1處的酰胺Ⅱ譜帶主要源自N-H彎曲振動與C-N拉伸相結(jié)合振動；1240cm-1處的酰胺Ⅲ譜帶主要歸因于C-H伸縮振動。此外，酰胺Ⅲ與1450帶的吸收比也被認為可以評估膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的完整性。

小牛皮膚膠原蛋白樣品與0～8mmol/L硅酸鈉混合，自組裝后均具有相似的特征峰，說明各濃度硅酸鈉促進形成的原纖維均具有相似的二級結(jié)構(gòu)，且AⅢ/A1450的比值均為1.0左右。說明所有自組裝樣品的三螺旋均是完整的[16]。

3.5 圓二色光譜術(shù)

在膠原蛋白中，酰胺發(fā)色團由肽鍵的羰基（C=O）和氨基（NH）形成。由于氮原子和氧原子的非鍵合電子之間的躍遷，這些酰胺發(fā)色團在UV區(qū)域表現(xiàn)出吸收。而手性分子與圓偏振光相互作用而導(dǎo)致左旋和右旋圓偏振光吸光度出現(xiàn)差異。膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)含有手性氨基酸，因此可以通過測量左旋和右旋偏振光的吸光度差異，了解膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)的信息。具有三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原蛋白在221～222nm出現(xiàn)正峰，在195～200nm出現(xiàn)負峰，且正峰與負峰的絕對值的比值越大，說明三螺旋結(jié)構(gòu)越完整[17]。

Zhu Lulu等[18]對來自鰩魚軟骨的胃蛋白酶可溶性膠原蛋白、來自鱘魚軟骨的胃蛋白酶可溶性膠原蛋白、鰩魚軟骨酸溶性膠原蛋白和鱘魚軟骨酸溶性膠原蛋白的研究表明，4種膠原蛋白的圓二色光譜均在221nm左右出現(xiàn)正峰，在200nm左右出現(xiàn)負峰，且Rpn分別為0.20、0.19、0.20、0.25，說明4種膠原蛋白均具有三螺旋構(gòu)象。

圓二色光譜是非破壞性的，允許對同一樣品進行重復(fù)測量，從而實現(xiàn)連續(xù)監(jiān)測。同時，圓二色光譜可提供二級結(jié)構(gòu)組成信息，但不能提供原子級細節(jié)。要深入了解更詳細的結(jié)構(gòu)，可以考慮使用其他技術(shù)，如X射線衍射、核磁共振波譜法等。

3.6 核磁共振波譜法

磁共振波譜分析原子核與外部磁場和射頻輻射的相互作用。在膠原自組裝的背景下，核磁共振波譜法檢測特定核的化學(xué)位移、耦合常數(shù)和弛豫時間的變化。這些變化提供了有關(guān)構(gòu)象變化、分子動力學(xué)和相互作用的信息，有助于深入了解膠原蛋白在自組裝過程中的結(jié)構(gòu)動態(tài)。

核磁共振波譜法也是一種非破壞性技術(shù)，可進行重復(fù)測量和進一步實驗。因為不受芳香環(huán)的影響，這種方法可以成為表征膠原蛋白自組裝的有效工具，可提供原子級分辨率并深入了解膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、動力學(xué)和相互作用。核磁共振波譜法通過化學(xué)位移變化識別酯化反應(yīng)，并通過Pro-dH的高場位移量化三螺旋的形成由三螺旋形成引起的單個質(zhì)子的屏蔽是膠原蛋白溫度依賴性的可靠證明[19]。與13C相比，1H具有更高的旋磁比，更適合生物大分子的結(jié)構(gòu)解析[20]。由于能夠提供有關(guān)膠原蛋白構(gòu)象變化、分子運動和結(jié)合相互作用的信息，使其處于組織工程、生物材料設(shè)計和再生醫(yī)學(xué)研究的前沿。雖然在靈敏度和儀器方面存在挑戰(zhàn)，但磁共振波譜仍然是揭示膠原蛋白自組裝復(fù)雜細節(jié)、促進對組織力學(xué)的理解以及推動創(chuàng)新生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用開發(fā)的基石技術(shù)。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，核磁共振波譜法將在闡明膠原蛋白自組裝的復(fù)雜性方面發(fā)揮核心作用。

4.小結(jié)

總之，上述方法都能提供有關(guān)膠原蛋白自組裝的獨特信息：紫外-可見光譜可以監(jiān)測分子環(huán)境和相互作用的總體變化；紅外光譜可以提供有關(guān)膠原蛋白化學(xué)鍵和官能團的構(gòu)成，有助于二級結(jié)構(gòu)分析；圓二色光譜專注于膠原蛋白的手性結(jié)構(gòu)，揭示二級結(jié)構(gòu)成分（如α螺旋）的變化；磁共振波譜可以提供自組裝過程中結(jié)構(gòu)變化、構(gòu)象動力學(xué)和分子相互作用的原子級信息。綜合運用各種檢測方法，有助于從不同維度加深對膠原蛋白自組裝的理解，建立起膠原蛋白類醫(yī)療產(chǎn)品質(zhì)量控制和評價有效方法。