夏曉楊 方飛 劉燕 車超 柯錦娟 姜勝軍

1.湖北省中西醫(yī)結合醫(yī)院口腔科，武漢430015；2.武漢大學人民醫(yī)院口腔科，武漢430060

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcino‐ma，OSCC）作為頭頸部常見的惡性腫瘤，病因多樣、機制復雜，近年來發(fā)病率呈升高趨勢[1]。雖然現有的臨床治療手段不斷進步，但患者預后依然改善有限，5年總體生存率維持在50%[2]。研究[3]指出，早期淋巴結轉移和復發(fā)是影響患者預后的主要因素。因此，深入研究影響OSCC轉移及復發(fā)的相關機制或敏感基因，對指導患者診療及改善預后有重要價值。親環(huán)蛋白A（cyclophilin A，Cy‐PA）作為親環(huán)素蛋白家族成員，與細胞裝配、折疊、運輸及免疫炎癥調節(jié)等密切相關[4]，其可能發(fā)揮癌基因的作用而參與腫瘤發(fā)生，與腫瘤細胞轉錄、凋亡及侵襲轉移等密切相關[5]。本研究分析了OSCC 組織中CyPA 蛋白表達，探討其與臨床指標的相關性，以及與OSCC細胞增殖和侵襲的關系。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

選取湖北省中西醫(yī)結合醫(yī)院口腔科2015 年2月—2018 年2 月接受手術治療且臨床資料完整的OSCC 患者77 例，均為原發(fā)病例且術前未行放化療，術后病理學檢查證實為OSCC。其中，男性46例，女性31 例，年齡34～76 歲，平均年齡（57.6±11.3）歲。按照第七版美國癌癥聯合委員會和國際抗癌聯盟TNM 分期標準：T1期19 例，T2期23 例，T3期21例，T4期14例；臨床分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期15例，Ⅲ期27例，Ⅳ期18例；分化程度：中低分化42 例，高分化35 例；發(fā)生淋巴結轉移36 例。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑和設備

免疫組化試劑盒及配套試劑（上海碧云天生物技術有限公司），兔抗人CyPA 多克隆抗體（Ab‐cam 公司，美國），SCC-25 細胞系（ATCC 公司，美國），胰蛋白酶、胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)液（Gibco 公司，美國），總RNA 提取試劑（Trizol法）、Lipofectamine 2000 轉染試劑（Invitrogen 公司，美國），逆轉錄和聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑（大連寶生物工程有限公司），甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tet‐razolium，MTT）液、二甲基亞砜（dimethyl sulf‐oxide，DMSO）（Sigma 公司，美國），Transwell小室（Corning 公司，美國），實時熒光定量PCR儀（Roche 公司，瑞士），凝膠電泳分析系統(tǒng)（Bio-Rad 公司，美國）。CyPA 干擾序列及陰性對照序列由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成，CyPA和內參引物由上海生工生物公司設計合成。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法檢測OSCC 和癌旁組織中CyPA蛋白表達 采用免疫組化SP 法，取OSCC 和癌旁組織石蠟標本，連續(xù)切片（厚度為4 μm），二甲苯脫蠟至水，PBS 沖洗3 次，加入3%過氧化氫反應15 min，PBS沖洗，置于枸緣酸鈉緩沖液中高壓高溫行抗原修復，PBS 沖洗3 次，加入一抗兔抗人CyPA 多克隆抗體（稀釋比例1∶800），4 ℃過夜孵育，PBS 沖洗3 次，加入二抗，室溫下培養(yǎng)120 min，PBS沖洗3次，DAB 顯色，蘇木精復染，脫水、透明、封片、觀察。高倍鏡下觀察，隨機取5 個高倍視野，CyPA 蛋白主要表達于細胞漿，根據染色強度和陽性細胞比例判定結果[6]，具體如下。1）染色強度：不著色、淡黃色、棕黃色和黃褐色分別賦予0、1、2 和3 分；2）陽性細胞比例：陽性細胞比例＜5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%分別賦予0、1、2、3和4分；3）將染色強度和陽性細胞比例得分相加，＜1 分為陰性（-），≥1分為陽性（+）。

1.3.2 細胞培養(yǎng)及分組 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)SCC-25細胞，培養(yǎng)條件：37 ℃、5%CO2、飽和濕度。待細胞豐度達80%以上時，胰酶消化，傳代。按Lipofectamine 2000 轉染試劑說明對對數生長期細胞進行分組轉染。1）CyPA 干擾序列組：轉染CyPA 小分子RNA 干擾（siRNA） 序列5,-GATCCGTGGTGACTTCACACGCCATAATTCAAGAGATTATGGCGTGTGAAGTCACCATTTTTTC-3,；2）陰性對照組：轉染陰性對照序列5,-AAGAGAAAAAGCGAAGAGCCA-3,；3）空白組：僅加入無血清培養(yǎng)液。

1.3.3 實時熒光定量PCR 技術檢測細胞中CyPA mRNA 表達 轉染后，各組培養(yǎng)48 h，加入胰酶及細胞裂解液，Trizol 法提取總RNA，檢測總RNA純度，按逆轉錄試劑盒說明完成逆轉錄，使用實時熒光定量PCR 儀對引物體系擴增，CyPA 上游引物序列：5,-CCACCGTGTTCTTCGACATCACG-3,，下游引物序列：5,-GCTCCTCTTGCCATTCCTGACCC-3,；磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phos‐phate dehydrogenase，GAPDH）上游引物序列：5,-CGTCTTCACCACCATGGAGAAGGC-3,；下游引物序列：5,-AAGGCCATGCCAGTGAGCTTCCC-3,。PCR 條件：94 ℃2 min，94 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃30 s，連續(xù)循環(huán)38次，每個樣品設6個復孔。采用2-△△Ct法獲得各組細胞中CyPA mRNA 相對表達量[7]。

1.3.4 Western blot 法檢測細胞中CyPA 蛋白表達轉染后，各組培養(yǎng)48 h，加入胰酶及細胞裂解液，提取總蛋白，按照BCA試劑盒說明檢測蛋白濃度。取50 μg 總蛋白行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE），電轉至聚偏氟乙烯膜，脫脂奶粉封閉120 min，然后將一抗按1∶1 000稀釋后加入，4 ℃過夜孵育，加入二抗，室溫反應60 min，加入發(fā)光試劑，以GAPDH 為內參獲得CyPA蛋白相對表達量。

1.3.5 細胞增殖實驗 1）MTT 法：用胰酶對各轉染組細胞消化，接種于96孔板，密度為每孔2×104個，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于24、48、72 和96 h 時，向各孔加入MTT 液20 μL，培養(yǎng)5 h，加入DMSO 200 μL，振蕩均勻，置酶標儀于490 nm 波長處檢測其光密度（optical density，OD）值，用以反映細胞增殖能力[8]。2）平板集落形成實驗：取各組轉染培養(yǎng)24 h 細胞，胰酶消化，離心重懸，接種于6 孔板，密度為每孔1×103個，盡量讓細胞在板底分布均勻，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，出現克隆斑時，棄培養(yǎng)液，PBS 沖洗1 次，甲醛固定，結晶紫染色，晾干、拍照。

1.3.6 細胞侵襲實驗 用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋Matrigel 基質膠，將稀釋液包被Transwell 小室上室。用胰酶對各組轉染后48 h 細胞消化，離心，使用無血清培養(yǎng)液重懸（每毫升1×106個），取200 μL 細胞懸液，置于小室上室，將含10%胎牛血清的培養(yǎng)液600 μL 加入下室，恒溫培養(yǎng)24 h，取小室，棄培養(yǎng)液，PBS 沖洗3 次，多聚甲醛固定，1%結晶紫染色，用棉簽將散落細胞輕輕除去，高倍鏡下觀察細胞穿膜情況。重復實驗3次[9-10]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 軟件對實驗結果進行分析，計數資料采用率值表示，兩組資料間比較使用χ2檢驗，多組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CyPA蛋白在OSCC和癌旁組織中表達

CyPA蛋白在OSCC組織中陽性表達率為76.62%（59/77），癌旁組織中為29.87%（23/77），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=33.805，P=0.000）（圖1）。

圖1 OSCC和癌旁組織中CyPA蛋白的表達 免疫組化染色Fig 1 The expressions of CyPA protein in OSCC and adjacent tissues immunohistochemical staining

2.2 CyPA蛋白在OSCC不同臨床指標間表達差異

CyPA 蛋白在不同性別和年齡間的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），CyPA 蛋白在T3+T4期、Ⅲ+Ⅳ期、中低分化和發(fā)生淋巴結轉移組織中的陽性表達率升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

2.3 3組細胞中CyPA mRNA和蛋白表達

CyPA 干擾序列組、陰性對照組和空白組細胞中CyPA mRNA 相對表達量分別為0.21±0.10、1.03±0.07 和1.02±0.04，差異有統(tǒng)計學意義（F=254.394，P＜0.001）。陰性對照組和空白組細胞中CyPA mRNA 相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（P=0.754），CyPA干擾序列組細胞中CyPA mRNA相對表達量低于其他兩組（P＜0.05）（圖2）。

表1 CyPA蛋白在OSCC不同臨床指標間表達差異Tab 1 The differences of the expressions of CyPA protein among different clinical indicators of OSCC

圖2 實時熒光定量PCR檢測3組細胞中CyPA基因表達Fig 2 Real-time fluorescence quantitative PCR was used to de‐tect the expressions of CyPA gene of cells in three groups

CyPA 干擾序列組、陰性對照組和空白組細胞中CyPA 蛋白相對表達量分別為0.38±0.09、0.76±0.08 和0.86±0.11，差異有統(tǒng)計學意義（F=42.286，P＜0.001）。陰性對照組和空白組細胞中CyPA 蛋白相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（P=0.079），CyPA干擾序列組細胞中CyPA 蛋白相對表達量低于陰性對照組和空白組（P＜0.05）（圖3）。

圖3 Western blot法檢測3組細胞中CyPA蛋白表達Fig 3 Western blot was used to detect the expressions of CyPA protein of cells in three groups

2.4 3組細胞增殖能力

MTT 實驗結果顯示，CyPA 干擾序列組24、48、72和96 h細胞OD值低于陰性對照組和空白組（P＜0.05），陰性對照組和空白組24、48、72和96 h細胞OD 值差異無統(tǒng)計學意義（P=0.582、0.660、0.598、0.226），具體見表2。平板集落形成實驗結果顯示，CyPA 干擾序列組、陰性對照組和空白組細胞集落數分別為（66.38±4.00）、（174.44±5.82）和（170.30±7.03） 個，差異有統(tǒng)計學意義（F=679.742，P＜0.001），CyPA 干擾序列組細胞集落數低于陰性對照組和空白組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），陰性對照組和空白組細胞集落數差異無統(tǒng)計學意義（P=0.232）（圖4）。

表2 3組細胞不同時點增殖能力比較Tab 2 Comparison on the proliferation ability of cells in the three groups at different time points

圖4 平板集落形成實驗檢測3組細胞增殖能力Fig 4 Plate colony formation test was used to detect the proliferation ability of cells in three groups

2.5 3組細胞侵襲能力

Transwell 實驗結果顯示，CyPA 干擾序列組、陰性對照組和空白組侵襲細胞數分別為（81.14±8.81）、（117.61±5.57）和（122.59±6.27）個，差異有統(tǒng)計學意義（F=62.337，P=0.000），侵襲細胞數在陰性對照組和空白組差異無統(tǒng)計學意義（P=0.238），CyPA 干擾序列組侵襲細胞數低于陰性對照組和空白組（P＜0.05）（圖5）。

圖5 Transwell實驗檢測3組細胞侵襲能力 結晶紫 ×200Fig 5 Transwell test was used to detect the invasion ability of cells in 3 groups crystal violet ×200

3 討論

近年來，OSCC發(fā)病率呈升高趨勢，由于口腔頜面部機械運動頻繁、血流豐富、淋巴結引流廣泛，易于腫瘤擴散轉移[11]，OSCC 患者早期便可出現轉移，已成為影響患者預后的重要危險因素[12]。研究[13]表明，OSCC 轉移和侵襲是一個涉及眾多基因激活或失活、多步驟、多階段的演化過程。Cy‐PA 是存在于各類細胞中的親環(huán)素蛋白家族成員[14]，其可能發(fā)揮促癌基因功能而參與了多種腫瘤發(fā)生進展過程[15]。有研究[16]指出，CyPA 促進了非小細胞肺癌轉移。與早期胃癌細胞增殖及移植瘤生長有關[17]。亦有研究[18]指出，CyPA 在口腔黏膜下纖維化表達上調，可能是潛在生物標志物和治療靶標。但CyPA 在OSCC 組織中表達如何，鮮有報道。本研究中CyPA 蛋白在OSCC 組織中呈高表達，可能發(fā)揮癌基因功能促進了OSCC 發(fā)生。同時，結果顯示，TNM 分期T3+T4期、臨床分期Ⅲ+Ⅳ期、中低分化和發(fā)生淋巴結轉移組織中CyPA 蛋白陽性表達率升高，進一步說明CyPA 蛋白可能參與了OSCC進展及惡性化過程。

本研究中CyPA干擾序列組細胞中CyPA mRNA和蛋白相對表達量明顯降低，提示SCC-25 細胞中CyPA mRNA 表達被成功抑制。有研究[19]指出，CyPA 對細胞周期具有調控作用，可通過調控細胞周期而參與細胞增殖及凋亡。本研究結果顯示，CyPA 干擾序列組24、48、72 和96 h 細胞OD 值低于陰性對照組和空白組，且細胞集落數減少，這些結果說明抑制SCC-25 細胞中CyPA mRNA 表達水平，可有效抑制細胞增殖能力，提示CyPA 可能參與了SCC-25細胞增殖過程。有研究[20]指出，Cy‐PA 表達上可促進癌細胞遷移。本研究中CyPA 干擾序列組侵襲細胞數低于陰性對照組和空白組，說明下調SCC-25 細胞中CyPA mRNA 表達水平，可抑制細胞侵襲能力，提示CyPA 基因可能參與了SCC-25細胞侵襲過程。

綜上所述，CyPA 蛋白在OSCC 組織中呈高表達，與腫瘤發(fā)生和進展密切相關，下調SCC-25 細胞中CyPA 基因表達，可抑制細胞增殖和侵襲能力，為開展機制研究及基因靶向治療提供新的方向。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。