賴冬萍，張 濤，廖美華，丁明健，楊 武

（1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧530000；2.廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧530011）

大腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界第三大 最 常 見 的 惡 性 腫 瘤，位 居 第 四 的 致 命 癌 癥［1，2］。目前現(xiàn)代醫(yī)學治療大腸癌的手段以手術(shù)為主，放化療為輔。相關(guān)研究表明，絞股藍和（或）半枝蓮單味中藥聯(lián)合化療在抑制大腸癌細胞活性及遷移 等 方 面 具 有 一 定 療 效［3，4］。

絞股藍（Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino）屬葫蘆科植物，性甘、涼，歸肺、脾、腎經(jīng)，為名貴藥材，《本草綱目》記載，具有清熱解毒、益氣健脾之效?，F(xiàn)代藥理機制研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、神經(jīng)保護等作用［5］。半枝蓮（Scutellaria barbata D. Don）系馬唇形科黃芩屬草本植物，最早見于《外科秘要》，性辛、平，入肺、肝、腎經(jīng)，具有清熱解毒，活血化瘀，消腫止痛之功。近期藥理學研究提示，半枝蓮具有抗癌、抗突變、解熱、促進免疫功能恢復等藥理作用［6，7］。

由于中醫(yī)藥成分的多樣性和與人體相互作用的復雜性，闡明中醫(yī)中藥的分子機制是促使古代中醫(yī)藥實踐與現(xiàn)代標準接軌的亟待解決的重要問題。目前對“絞股藍-半枝蓮”藥對抗大腸癌的機制研究報道較少，從分子水平闡述抗大腸癌的作用機制缺乏系統(tǒng)化。分子對接是預測受體與配體相互作用和反應(yīng)機制的模擬化手段，網(wǎng)絡(luò)藥理學是融合生物信息學、計算機技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)科學和系統(tǒng)藥理學為一體的新興學科［8］。疾病與化合物靶點網(wǎng)絡(luò)全局化、系統(tǒng)化與中醫(yī)的整體觀念一脈相通。本研究基于分子對接和現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，運用TCMSP、GeneCards、CTD、TTD 等數(shù)據(jù)庫收集絞股藍-半邊蓮藥對治療CRC 的相關(guān)靶點，構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點”、蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)、靶基因功能通路等多層次生物信息網(wǎng)絡(luò)，篩選出關(guān)鍵靶點和通路，進行活性成分與靶蛋白分子對接，探討絞股藍-半枝蓮藥對多成分、多靶點、多途徑防治大腸癌的作用機制，以期為中醫(yī)藥潛在藥物靶點防治大腸癌提供思路，為后續(xù)多靶點藥物研發(fā)和基礎(chǔ)及臨床研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 絞股藍-半枝蓮活性化合物的篩選

本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學和分析平臺TC?MSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），經(jīng) 過 查 閱文獻［9］，以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，分別篩選出絞股藍和半枝蓮符合條件的化合物。

1.2 絞股藍-半枝蓮有效化合物靶點的收集

將以上TCMSP 中篩選出來的有效化合物借助DrugBank 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.drugbank.ca/）獲取每個化合物的有效作用靶點，得到絞股藍-半枝蓮化合物潛在靶點信息。將靶點信息導入STRING 數(shù)據(jù)庫（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins，https：//string-db.org/）中Multiple Proteins 的檢索，選擇物種為“Homo sapiens”，剔除重復、非人源的靶點，規(guī)范靶點名稱。

1.3 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將收集的中藥化合物和有效靶點通過Cyto?scape 3.6.1 軟 件（http：// www.cytoscape.org/）構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.4 大腸癌疾病靶標的獲取

利 用GeneCards（https：//www. genecards. org/）、CTD 數(shù)據(jù)庫（http：//ctdbase. org/）和TTD 數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）查找與大腸癌相關(guān)的靶點。數(shù)據(jù)庫以關(guān)鍵詞“colorectal cancer”進行檢索，收集整合與大腸癌相關(guān)的靶標。

1.5 絞股藍-半枝蓮藥對與大腸癌的共同靶點及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建

通過Venn 2.1.0 在線分析工具獲得絞股藍-半枝蓮藥對和大腸癌共同交集的靶點，得出絞股藍-半枝蓮藥對防治大腸癌的作用靶點基因。再將其共同 靶 點 上 傳 至 在 線STRING11.0（https：//www.string-db.org/）獲取基因靶點，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，選取置信度高于0.7 的數(shù)據(jù)，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。 經(jīng)Cytoscape 中進行節(jié)點大小和顏色的調(diào)整，構(gòu)建共同作用靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）功能與KEGG通路富集分析

將上述篩選得到的絞股藍-半枝蓮藥對與大腸癌共同靶標導入DAVID6.8 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），設(shè)置物種為“Homo Sapiens”，對交集靶點進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。GO 功能分析包括生物過程（BP，biological pro?cess），細 胞 組 分（CC，cellular component），分子功能（MF，molecular function）。 將 分 析 結(jié) 果 運 用GraphPad 軟件和R 語言分析軟件進行可視化處理。

1.7 核心活性成分-靶點分子對接驗證

以“活性成分-靶標-疾病”網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點“Degree”參數(shù)大于均值為條件篩選核心化合物，并從TC?MSP 數(shù)據(jù)庫中下載核心化合物的mol2 文件，導入AutoDock Tools 1.5.6 軟件，保存為pdbqt 格式。從PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org）下載關(guān)鍵靶蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，通過PyMOL 軟件對蛋白質(zhì)進行移除水分子和多余的非活性配體，導入AutoDock Tools 1.5.6 軟件加氫、加電荷處理，輸出為pdbqt 格式。根據(jù)參數(shù)文件，用命令提示符（CMD）運行分子對接過程，選擇“Local Search Parameters”計算方法，對對接結(jié)果（Blind energy）進行打分，得出全局最優(yōu)結(jié)合構(gòu)象，利用Discovery Studio Visualizer 和PyMOL將對接結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選

根據(jù)TCMSP 平臺中OB ≥30% 和DL≥0.18的界定值和去重處理后，本研究共納入49 個活性化合物，其中絞股藍24 個，半枝蓮25 個（已去掉4 個重復化合物）。這49 個化合物包括人參皂甙f2（Gin?senoside f2）、槲皮素（Quercetin）、黃芩苷（Baicalin）、豆甾醇（Stigmasterol）、雌黃醇（Eriodictyol）、木犀草素（Luteolin）、復 方 黃 酮（Moslosooflavone）等。見表1。

表1 絞股藍-半枝蓮活性化合物基本信息Tab 1 Basic information of the active compounds of Gynostemma pentaphyllum-Scutellaria barbata

續(xù)表

2.2 絞股藍?半枝蓮藥對有效化合物靶點預測

通過DrugBank 數(shù)據(jù)庫對絞股藍-半枝蓮藥對中篩選出的49 個化合物進行靶點預測，再將這些靶蛋白導入STRING 數(shù)據(jù)庫中，剔除非人源蛋白和重復蛋白，最后整合共得到15 個化合物，116 個靶點。將得到的結(jié)果導入Cytoscape 軟件中構(gòu)建“化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。內(nèi)環(huán)紅色節(jié)點表示分子化合物MOL 編號，外環(huán)藍色節(jié)點表示潛在靶點。見圖1。

圖1 絞股藍-半枝蓮藥對化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Gynostemma pentaphyllum-Scutellaria barbata pair compound-target network diagram

2.3 絞股藍-半枝蓮藥對有效成分與大腸癌靶點的Venny 分析

從CTD、Genecards、TTD 三個數(shù)據(jù)庫篩 選出750 個大腸癌相關(guān)靶點，與絞股藍-半枝蓮藥對的116 個作用靶點取交集，獲得49 個交集靶點，分別為TP53、JUN、MAPK1、HSP90AA1、EGF、IL6、EG?FR、TNF、VEGFA、PTGS2、IL1B、ESR1、MAPK14等。見圖2。

圖2 絞股藍-半枝蓮藥對活性成分與CRC 靶點Venny 分析圖Fig 2 Gynostemma pentaphyllum-Scutellaria barbata active ingredient and CRC target Venny analysis chart

2.4 絞股藍-半邊蓮藥對與大腸癌的交集靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

將 49 個共同靶點上傳至 STRING11.0（https：//www.string-db.org/）規(guī)范基因靶點名稱，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，選取置信度高于0.7 的數(shù)據(jù)，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，利用Cytoscape 可視化處理，核心網(wǎng)絡(luò)圖包含47 個節(jié)點（剔除2 個游離靶蛋白），228 條邊，其中節(jié)點表示蛋白，每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系，線條越多表示關(guān)聯(lián)度越大，見圖3。平均度值是9.7，超過平均度值的靶點有19 個，推測這19 個靶點為絞股藍-半枝蓮作用于大腸癌的關(guān)鍵靶點。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲學性質(zhì)將靶點按照度值由高到低排序。見表2。

2.5 絞股藍-半枝蓮藥對與CRC 靶點全局性網(wǎng)絡(luò)分析

將絞股藍-半枝蓮藥對化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)和絞股藍-半枝蓮與CRC 交集作用靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)通過Cytoscape 軟件合成全局性蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。見圖4。

2.6 絞股藍-半枝蓮對大腸癌的作用靶點GO 功能富集注釋分析

圖3 絞股藍-半枝蓮對CRC 作用靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig 3 Protein interaction network of Gynostemma pentaphyllum-Scutellaria barbata against CRC

表2 PPI 網(wǎng)絡(luò)中大于平均度值的靶標蛋白Tab 2 Target proteins in the PPI network that are greater than the average value

圖4 絞股藍-半枝蓮藥對與CRC 靶點全局性共網(wǎng)絡(luò)Fig 4 Gynostemma pentaphyllum-Scutellaria barbata pair and CRC target global network

借助DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫的GO 富集分析功能，得出36 個生物學過程（biological process，BP）（P＜0.01），包括：Ras 蛋白信號轉(zhuǎn)導、肽基絲氨酸磷酸化、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、RNA 聚合酶II 啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、肽基蘇氨酸磷酸化、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、宿主共生體生長的負調(diào)控、調(diào)節(jié)細胞增殖、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中涉及的細胞因子產(chǎn)生、環(huán)氧合酶途徑等方面。11 個細胞組分（cellular component，CC）（P＜0.05），包括：細胞外空間、胞質(zhì)溶膠、轉(zhuǎn)錄因子復合體、染色質(zhì)、線粒體、高爾基體、核膜、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合物、復制叉、核染色質(zhì)等等。16 個分子功能（mo- lecular function，MF）（P＜0.01），包括：血紅素結(jié)合、類固醇結(jié)合、核心啟動子序列特異性DNA 結(jié)合、細胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA 結(jié)合、序列特異性DNA 結(jié)合、ATP 結(jié)合、生長因子活性、過氧化物酶活性、前列腺素-內(nèi)過氧化物合酶活性、組蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性，序列特異性DNA 結(jié)合等方面。具體GO 分析注釋見圖5。

2.7 絞股藍-半枝蓮對大腸癌的作用靶點KEGG通路富集分析

通過DAVID6.8 數(shù)據(jù)庫進行KEGG 通路富集分析功能，分析結(jié)果顯示絞股藍-半枝蓮藥對作用于大腸癌的通路有67 條（P＜0.01），包括癌癥信號通路、膀胱癌、HIF-1 信號通路、胰腺癌、PI3K-Akt 信號通路、炎癥性腸病、結(jié)直腸癌、癌癥中的MicroRNA、p53 信號通路、NF-κ B 信號通路、細胞凋亡等信號通路。將KEGG 通路富集分析的前30 條通路導入R 語言分析軟件進行可視化處理，見圖6。相關(guān)性較大的癌癥信號通路圖，見圖7。

圖5 絞股藍?半枝蓮對CRC 作用靶點的GO 功能富集BP、CC、MF 分析柱狀圖Fig 5 The histogram of BP，CC，MF analysis of GO function enrichment of Gynostemma pentaphyllum-Scutellaria barbata on the target of CRC

2.8 核心成分作用于關(guān)鍵靶點的分子對接結(jié)果

在“ 活性成分-靶標-疾病”網(wǎng)絡(luò)分析中，根據(jù)拓撲學參數(shù)計算得出排名前五的核心化 合 物 為 ：MOL000098 （ 槲 皮 素 ） 、MOL000351（3，7-二 甲 氧 基-3'，4'，5-三 羥 基黃 酮）、MOL000358（β-谷 甾 醇）、MOL005440（異 木 甾 醇）、MOL000006（木 犀 草 素）。 分子對接方法通過匹配原則算法模擬蛋白質(zhì)與小分子受體互作。 研究表明，配體與受體結(jié)合能量越低，結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，相互作用的可能性越大［10］。 本研究結(jié)果顯示絞股藍-半枝蓮的核心化合物與大腸癌共同靶點結(jié)合能（Blind energy）均為負值，提示化合物與受體有一定的結(jié)合活性，結(jié)合能小于?5 kJ/mol 證 明 有 較 強 的 結(jié) 合 活 性［11］。 分 子 對接結(jié)果見圖8，有強烈的結(jié)合活性化合物與受體分子對接模式見圖9。 表明絞股藍-半枝蓮藥對的活性成分與大腸癌交集的靶標蛋白具有較好的結(jié)合活性。

圖6 絞股藍-半枝蓮藥對與大腸癌作用靶點的KEGG 分析的氣泡圖（Top30）Fig 6 Bubble diagram of KEGG analysis of the target of Gynostemma pentaphyllum-Scutellaria barbata against colon cancer（Top30）

圖7 絞股藍-半枝蓮對CRC 作用的Pathways in cancer 信號通路靶基因的KEGG 通路分析Fig 7 KEGG pathway analysis of the target genes of pathways in cancer signaling pathway of Gynostemma pentaphyllum-Scutellaria barbata on CRC

圖8 絞股藍-半枝蓮對CRC 作用靶點分子對接的結(jié)合能Fig 8 Binding energy of Gynostemma pentaphyllum-Scutellaria barbata to CRC target molecular docking（- kJ/mol）

圖9 核心活性成分與潛在治療靶點分子對接模式Fig 9 Molecular docking mode of core active ingredients and potential therapeutic targets

3 討論

大腸癌在中醫(yī)歸屬“腸瘤”、“腸蕈”等范疇，《靈樞·刺節(jié)真邪》云：“虛邪之入于身也深，寒與熱相搏，久留而內(nèi)著，……津液久留，合而為腸瘤，久者數(shù)歲乃成，以手按之柔?！逼渲嗅t(yī)基本病機是本虛標實，寒熱互結(jié)，津液久滯于體內(nèi)，故為“腸瘤”。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)大腸癌以“脾胃虛弱為本、濕熱瘀毒為標”而貫穿疾病始終［12］，當以健脾清熱活血為治療大法。肺與大腸相表里，大腸主津，以通為用，肺通調(diào)水道，布散津液，二者互為表里，相輔相成。若肺失肅降，水液輸布失常，大腸傳導失司，濕、瘀、毒易留于腸腑，而為腸癌［13］。絞股藍-半枝蓮藥對具有清熱解毒、活血化瘀、益氣健脾之效，化瘀散結(jié)，調(diào)經(jīng)通絡(luò)，皆為抗癌要藥［14］?！爱惒⊥巍笔侵嗅t(yī)整體觀的內(nèi)涵，“絞股藍-半枝蓮”藥對防治大腸癌蘊含了以肺之藥治療大腸病變的“肺腸合治”思想。本研究通過分子對接及現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理學方法初步探討“絞股藍-半枝蓮”抗大腸癌的分子機制，從多靶點、多信號通路的角度揭示其抗大腸癌的作用機理。

本研究結(jié)果顯示，“絞股藍-半枝蓮”藥對有效活性化合物共15 個，對應(yīng)靶點116 個，與大腸癌相關(guān)的共同靶點49 個。關(guān)鍵的活性成分為β-谷甾醇、人參皂甙f2、槲皮素、異木甾醇、黃芩苷、木犀草素、復方黃酮等等，同時也是對接較好的活性化合物。人參皂甙已被證實可誘導大腸癌細胞周期阻滯和凋亡［15］。槲皮素對HCT-116 細胞具有強細胞毒性和抗氧化應(yīng)激作用［16］。黃芩苷通過下調(diào)SP1 轉(zhuǎn)錄因子誘導SW480 細胞凋亡［17］。研究發(fā)現(xiàn)木犀草素和天然黃酮類化合物具有很強的促腫瘤凋亡、抑制腫瘤增殖和阻斷腫瘤血管生成的能力，具有良好的先導 抗 腫 瘤 效 用［18，19］。構(gòu) 建 絞 股 藍-半 枝 蓮 藥 對 與CRC 的蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)后發(fā)現(xiàn)其潛在的核心靶蛋 白 為TP53、JUN、MAPK1、HSP90AA1、EGF、IL6、EGFR、TNF、VEGFA 等。TP53 屬腫瘤抑制蛋白，可誘導細胞周期停滯、凋亡，其突變普遍存在各種癌癥。相關(guān)Meta 分析表明，TP53 可能作為炎癥性腸病相關(guān)大腸癌和發(fā)育異常篩查的生物標志物和治療靶點［20］。TP53 突變可導致炎癥和先天免疫途徑的顯著激活，誘導大腸癌的進展［21］，與大腸癌預后和免疫應(yīng)答密切相關(guān)［22］。JUN 原癌基因參與惡性腫瘤易位和缺失。MAPK1 作為多種生化信號的整合點，參與增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和發(fā)育等多種生物學過程。 miR-422a 通過靶向AKT1 和MAPK1 抑制結(jié)直腸癌細胞增殖［23］。消化道腫瘤生物標記物網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，TP53、EGFR 和HSP90AA1 可作為大腸癌的預測性生物標記物［24］。Toyoshima 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，IL6 是腫瘤攜帶狀態(tài)下產(chǎn)生的促炎細胞因子，IL6 低表達可提高宿主的免疫，從而抑制大腸癌轉(zhuǎn)移［26］。越來越多的證據(jù)表明，抑制TNF-α 誘導的EMT 和大腸癌細胞遷移和侵襲，成為潛在靶點［27］。Dilshar 等［28］通過體外實驗證實P53 介導的氧化應(yīng)激通過上調(diào)DR5 和誘導TNF 凋亡增強了I3M 誘導的結(jié)腸癌細胞凋亡。在一項前瞻性回顧性研究中，發(fā)現(xiàn)不同的VEGFA 亞型的生物學作用和預后意義在右側(cè)和左側(cè)原發(fā)性結(jié)腸癌中存在差異［29］。下調(diào)NEAT1 和VEGFA 可抑制大腸癌細胞增殖、遷移和侵襲［30］。綜上可見，絞股藍-半枝蓮藥對的有效成分靶點與大腸癌的疾病靶點相互作用，充分發(fā)揮中藥多成分、多靶點的獨特優(yōu)勢，防治大腸癌的效用。

在絞股藍-半枝蓮對CRC 的GO 分析結(jié)果得出36 個生物學過程（P＜0.01），主要包括Ras 蛋白信號轉(zhuǎn)導、宿主共生體生長的負調(diào)控、調(diào)節(jié)細胞增殖、調(diào)節(jié)炎癥因子等方面。炎癥是大腸癌發(fā)生的驅(qū)動因素，推測絞股藍-半枝蓮通過下調(diào)炎性因子表達，從而抑制腫瘤細胞的增殖，這可能是開發(fā)有效的癌癥抗炎免疫療法的希望目標。絞股藍-半枝蓮可能通過調(diào)節(jié)大腸癌腫瘤微環(huán)境，協(xié)調(diào)宿主與共生體的平衡，從而實現(xiàn)機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。在絞股藍-半枝蓮對CRC 的KEGG 通路富集分析結(jié)果得出67 條信號通路（P＜0.01），其中富集靶點最多的是癌癥通路，涉及促炎癌變機制、miRNA 調(diào)控機制、細胞凋亡等等?，F(xiàn)有研究表明，多種MicroRNA 可作為大腸癌患者預后的生物標志物［31］。中醫(yī)藥可能通過直接或間接靶向調(diào)節(jié)相應(yīng)miRNA 表達，繼而恢復miRNA 與癌基因或抑癌基因之間的平衡狀態(tài)，維持機體的陰陽平衡，達到防治癌病的作用，實現(xiàn)治病求本。絞股藍-半枝蓮藥對活性成分通過多信號、多途徑而實現(xiàn)對大腸癌的調(diào)控。

本研究基于分子對接和網(wǎng)絡(luò)藥理學層面對絞股藍-半枝蓮藥對抗大腸癌的活性成分、潛在靶點和作用機制進行了初步預測。從15 種化合物中篩選得到116 個活性潛在靶點與大腸癌的49 個靶點顯著相關(guān)。這些關(guān)鍵靶點可能通過抗炎、抗氧化應(yīng)激、正向調(diào)控細胞凋亡、維持機體穩(wěn)態(tài)等方面實現(xiàn)藥效作用。本研究還挖掘了30 條絞股藍-半枝蓮藥對防治大腸癌的潛在信號通路，為進一步的實驗研究、多靶點藥物研發(fā)提供基礎(chǔ)和方向。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法具有一定的局限性，后期仍需開展生物學實驗驗證相關(guān)通路及大量循證醫(yī)學證據(jù)支持。