王 朝，安 健，李曉紅，杜 葉

（1.山西醫(yī)科大學(xué)，2.山西省心血管病醫(yī)院心內(nèi)科，山西 太原030001）

冠心病，尤其是心肌梗死是當(dāng)今社會導(dǎo)致死亡的重要因素之一［1］，而閉塞冠狀動脈的早期再通，可使面臨壞死的心肌得以保存或使心肌壞死面積減小，但對心肌進行早期再灌注卻常常伴隨心肌收縮舒張功能下降、再灌注性心律失常發(fā)生、心肌能量代謝變化以及心肌結(jié)構(gòu)的變化，即心肌缺血再灌注損 傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）［2］。減輕缺血再灌注損傷是減輕心梗損傷的重要環(huán)節(jié)，心肌缺血后適應(yīng)是其中一種重要方法，可分為原位缺血后適應(yīng)（local ischemic postcondi?tioning）及遠(yuǎn)端肢體缺血后適應(yīng)（remote ischemic postconditioning）［3，4］，而 遠(yuǎn) 端 肢 體 缺 血 后 適 應(yīng) 由 于其時機可預(yù)料、操作較簡單，引起越來越多學(xué)者的關(guān)注［5，6］。本實驗通過原位缺血后適應(yīng)與遠(yuǎn)端肢體缺血后適應(yīng)兩種處理方式，比較氧化應(yīng)激指標(biāo)、心肌壞死面積、心功能的改變，為減緩心肌缺血再灌注損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SOD、MPO、XOD 測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）、大鼠腫瘤壞死因子-α 試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）、CK-MB ELISA Kit（武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）、HX-101E 小動物呼吸機（成都泰盟有限公司）、心電圖記錄儀（BL-410 生物機能實驗系統(tǒng)）、GEVIVID7 彩色多普勒超聲儀（美國GE 公司）、酶標(biāo)儀DENLEY DRAGON Wells?can MK 3（Thermo）、洗 板 機Wellwash 4 MK2（Thermo）、漩渦混合器XW-80A（上海青浦滬西儀器廠）、連續(xù)分液器（TOMOS LIFE SCIENCE Group）、高通量組織研磨器（寧波新芝）。

1.2 模型建立

健康SD 雄性大鼠32 只，重量220～250 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，研究經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會的批準(zhǔn)。10% 水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔麻醉，連接心電圖記錄儀；頸部正中皮膚切開，氣管插管接小動物呼吸機（潮氣量7 mL、呼∶吸5∶4、呼吸頻率60 次/min）；分離左胸部皮膚及肌肉組織，離斷3、4 肋骨，眼瞼撐開器撐開胸廓暴露心臟，跨越左心耳及肺動脈圓錐之間，接扎冠狀動脈造成心肌缺血，成功標(biāo)志為心電圖ST 段抬高或心尖變白；缺血30 min 后恢復(fù)再灌注，再灌注標(biāo)志為抬高ST 段下降一半以上［7］。

1.3 實驗分組

（1）假手術(shù)（Sham）組：前降支穿線但不結(jié)扎；（2）缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）組：前降支結(jié)扎30 min，解剖雙側(cè)股動脈但不予夾閉，恢復(fù)再灌注3 h；（3）原位缺血后適應(yīng)（local ischemic post?conditioning，LIPC）組：前降支結(jié)扎30 min，解剖雙側(cè)股動脈但不予夾閉，隨后對前降支進行解除-結(jié)扎各30 s，共3 個循環(huán)，其后恢復(fù)前降支血流3 h；（4）遠(yuǎn)端肢體缺血后適應(yīng)（remote ischemic postcondition?ing，RIPC）組：前降支結(jié)扎30 min，解剖雙側(cè)股動脈并對其解除-結(jié)扎各5 min，共3 個循環(huán)，其后恢復(fù)前降支血流3 h。

1.4 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)以及CK-MB 的測定

造模完成后即刻經(jīng)腹主動脈采血，離心機離心后將血清保存于?80℃冰箱，待造模工作完成后，將血清分別作如下檢測：SOD（WST-1 法）、MPO（比色法）、XOD（比色法）按照試劑盒說明測定濃度，TNF-α、CK-MB 采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法嚴(yán)格按照試劑盒說明測定濃度。

1.5 心肌梗死面積測定

腹主動脈采血后摘除心臟并沖洗，沿左心室長軸方向?qū)⑿呐K平均切為5 片，置于37℃2%TTC 溶液中孵育20 min，浸于多聚甲醛（4%）24 h 后取出，相機拍照，其中梗死區(qū)呈現(xiàn)白色，未梗死區(qū)呈現(xiàn)紅色，采用Image-J 分析軟件分析心梗面積百分比，心梗面積百分比=梗死區(qū)面積/總心肌面積。

1.6 大鼠心功能測定

應(yīng)用GEVIVID7 多普勒超聲儀檢測各組大鼠的LVIDd、LVIDs、EF。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 血清氧化應(yīng)激及炎癥因子指標(biāo)的比較

與Sham 組相比，I/R 組、LIPC 組、RIPC 組SOD明 顯 減 小，XOD、MPO、TNF-α 明 顯 增 大（P＜0.05）；與I/R 組相比，LIPC 組TNF-α 明顯減?。≒＜0.05），其余氧化應(yīng)激指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異；與I/R 組相 比，RIPC 組MPO、TNF-α 值 明 顯 減 ?。≒＜0.05），SOD、XOD 無統(tǒng)計學(xué)差異；與LIPC 組相比，RIPC 組MPO 明顯減?。≒＜0.05），余各氧化應(yīng)激指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異。見表1。

表1 各組血清氧化應(yīng)激及炎癥因子指標(biāo)結(jié)果（n=8，±s）Tab 1 Serum oxidative stress indicators and inflammatory factors results（n=8，±s）

表1 各組血清氧化應(yīng)激及炎癥因子指標(biāo)結(jié)果（n=8，±s）Tab 1 Serum oxidative stress indicators and inflammatory factors results（n=8，±s）

注：與Sham 組相比，*P＜0.05；與I/R 組相比，#P＜0.05；與LIPC 組相比，&P＜0.05。

TNF-α(pg/mL)13.53±2.84 29.18±8.53*21.81±8.30*#21.31±7.54*#6.325 0.002組別Sham 組I/R 組LIPC 組RIPC 組FP SOD（U/mL）138.70±7.58 128.45±8.27*129.44±9.98*129.61±7.26*2.641 0.069 XOD（U/L）15.23±2.23 20.36±5.46*20.54±5.00*19.97±4.79*2.502 0.080 MPO（U/L）16.69±4.35 36.63±9.63*39.82±9.96*26.11±10.81*#&10.825＜0.001

2.2 心梗面積、CK-MB 的比較

與Sham 組相比，LIPC 組、RIPC 組、I/R 組心梗面積及CK-MB 明顯增大（P＜0.05）；與I/R 組相比，LIPC 組、RIPC 組 心 梗 面 積 及CK-MB 無 統(tǒng) 計 學(xué) 差異（P＞0.05）；LIPC 組與RIPC 組間相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表2。

2.3 大鼠心功能指標(biāo)比較

與Sham 組 相 比，LIPC 組、RIPC 組、I/R 組LVIDs 明顯增加，EF 值明顯減?。≒＜0.05）；與I/R組相比，LIPC 組、RIPC 組左室容積及射血分?jǐn)?shù)無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），LIPC 組與RIPC 組間相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表3。

2.4 TTC 染色

心肌組織經(jīng)TTC 染色后，梗死區(qū)呈現(xiàn)為白色，而非梗死區(qū)呈紅色。圖1 可見Sham 組心肌組織呈紅色，未見明顯白染區(qū)；I/R 組可見白色梗死區(qū)；LIPC 組、RIPC 組與其相比未見明顯改善，見圖1。

表2 各組心梗面積與CK-MB 結(jié)果（n=8，±s）Tab 2 Myocardial infarction area and CK-MB results（n=8，±s）

表2 各組心梗面積與CK-MB 結(jié)果（n=8，±s）Tab 2 Myocardial infarction area and CK-MB results（n=8，±s）

注：與Sham 組相比，*P＜0.05。

CK-MB(pg/mL）768.95±99.61 1 126.16±256.77*1 064.80±258.63*998.99±251.83*3.950 0.018組別Sham 組I/R 組LIPC 組RIPC 組FP心梗面積（%）6.88±1.55 17.00±4.04*14.40±5.03*15.04±5.15*8.942＜0.001

圖1 各組心肌組織TTC 染色后形態(tài)Fig 1 The shape of myocardial tissue after TTC staining in each group

表3 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（n=8，±s）Tab 3 Cardiac function results（n=8，±s）

表3 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（n=8，±s）Tab 3 Cardiac function results（n=8，±s）

注：與Sham 組相比，*P＜0.05。

組別Sham 組I/R 組LIPC 組RIPC 組EF（%）85.75±6.63 67.13±5.91*69.00±8.18*65.50±8.18*10.825＜0.001 FP LVIDd（mm）4.99±0.54 5.17±0.28 5.28±0.49 5.39±0.49 1.081 0.373 LVIDs（mm）2.39±0.34 3.05±0.53*3.07±0.29*3.03±0.48*4.884 0.007

3 討論

缺血再灌注損傷的發(fā)生由多個環(huán)節(jié)導(dǎo)致。梗死后心肌恢復(fù)再灌注，可使氧化應(yīng)激反應(yīng)增多，鈣超載，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放以及炎癥損傷，其中氧化應(yīng)激反應(yīng)激活是導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷的主要機制之一［8-9］。本實驗顯示：各組氧化應(yīng)激指標(biāo)與Sham 組相比有統(tǒng)計學(xué)差異，提示心梗模型造 模 成 功。LIPC 組 與I/R 組 相 比TNF-α 明 顯 減 ?。≒＜0.05），余各氧化應(yīng)激指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異，提示原位缺血后適應(yīng)可一定程度減輕缺血再灌注損傷的氧化應(yīng)激反應(yīng)，分析結(jié)果產(chǎn)生的原因為：（1）樣本量較小，結(jié)果代表性不強；（2）：反復(fù)的對前降支進行解除-結(jié)扎操作本身可能加重了心肌損傷，抵消缺血后適應(yīng)帶來的獲益；（3）：可能原位缺血后適應(yīng)對心肌缺血再灌注損傷的氧化應(yīng)激反應(yīng)改善不明顯；與I/R 組相 比，RIPC 組MPO、TNF-α 值明顯減?。≒＜0.05），SOD、XOD 無統(tǒng)計學(xué)差異，提示遠(yuǎn)端肢體缺血后適應(yīng)可一定程度減輕缺血再灌注損傷的氧化應(yīng)激反應(yīng)，分析結(jié)果產(chǎn)生的原因為：（1）遠(yuǎn)端肢體缺血后適應(yīng)確可減輕缺血再灌注損傷的氧化應(yīng)激反應(yīng)，但由于本實驗樣本量較小，體現(xiàn)不明顯；（2）可能遠(yuǎn)端肢體缺血后適應(yīng)實施時間較短，并未對缺血再灌注損傷產(chǎn)生明顯作用；與LIPC 組相比，RIPC 組MPO 明顯減?。≒＜0.05），可能與LIPC 組反復(fù)結(jié)扎冠狀動脈加重心肌損傷有關(guān)，余各氧化應(yīng)激指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異，說明原位缺血后適應(yīng)與遠(yuǎn)端肢體缺血后適應(yīng)之間作用類似。

心肌缺血后適應(yīng)可能減輕缺血再灌注損傷并已部分應(yīng)用于臨床，如急診PCI 術(shù)中對梗死相關(guān)動脈短時間內(nèi)通過球囊反復(fù)短暫阻斷血流實施原位缺血后適應(yīng)，急診PCI 術(shù)前對遠(yuǎn)端組織通過血壓計反復(fù)短暫阻斷血流實施遠(yuǎn)端肢體缺血后適應(yīng)，但新近臨床研究表明他們對心?；颊叩呐R床預(yù)后并未產(chǎn)生明顯改善作用［10-14］。本研究顯示與I/R 組相比，LIPC 組、RIPC 組的CK-MB、心梗面積雖然并沒有產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)差異，但有減小的趨勢，心功能指標(biāo)LVIDd、LVIDs、EF 無統(tǒng)計學(xué)差異；LIPC 組與RIPC組相比較，結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異，表明原位缺血后適應(yīng)與遠(yuǎn)端肢體缺血后適應(yīng)有減輕心肌損傷的趨勢，這種趨勢可能與他們減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。但可能由于改善作用有限，均未明顯改善心功能，這與上述臨床研究的結(jié)果相對應(yīng)。

綜上所述，原位缺血后適應(yīng)與遠(yuǎn)端肢體缺血后適應(yīng)雖然沒有明顯改善心功能，但有減小心肌損傷的趨勢，這種作用可能與他們減少氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。也與本實驗樣本量較小、缺血后適應(yīng)處理時間較短等因素相關(guān)。也為缺血后適應(yīng)應(yīng)用于臨床提出更多挑戰(zhàn)。