◎ 范 蕊，王文文，盧 彬，曹雪琴

（新疆維吾爾自治區(qū)分析測試研究院，新疆 烏魯木齊 830011）

菌落總數(shù)是食品的衛(wèi)生指標(biāo)之一，反應(yīng)食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量。菌落總數(shù)的測定看似簡單，但由于食品基質(zhì)復(fù)雜，微生物受損傷程度不一，恢復(fù)能力不同，所需要的營養(yǎng)要素不同等，要在同等條件下把所有的細(xì)菌都培養(yǎng)出來，實(shí)屬不易[1]。目前，我國食品微生物菌落總數(shù)的檢測主要依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2016）、 《進(jìn)出口食品中菌落總數(shù)計(jì)數(shù)方法》（SN/T 0168—2015）、 《出口飲料中菌落總數(shù)、大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌計(jì)數(shù)方法 疏水柵格濾膜法》（SN/T 1607—2017）以及《商品化試劑盒檢測方法 菌落總數(shù) 方法一》（SN/T 4544.1—2016）。

國際上，美國AOAC 標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于菌落總數(shù)比較多，主要有《食品化妝品細(xì)菌總數(shù)螺旋平板法》（AOAC 977.27—1981）、《食品細(xì)菌總數(shù)濾膜法》（AOAC 986.32—1987）、《食品中細(xì)菌總數(shù)的Redigel 果膠法》（AOAC 988.18—1990）及《食品中細(xì)菌總數(shù)的檢測 再水化干膜法》（AOAC 990.12—1994）；加拿大食藥局采用的是《食品菌落總數(shù)3M 法》；英國菌落總數(shù)等同采用了ISO 4833—2013；我國的標(biāo)準(zhǔn)也是以ISO4833—2013 為基礎(chǔ)，修訂完成的。

大腸菌群是一群革蘭氏陰性、桿狀、無芽孢、兼性厭氧及能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的腸道細(xì)菌的總稱。它并非細(xì)菌分類學(xué)上的命名，也不代表某一種或某一屬的細(xì)菌，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域用語，特指具有某些特性的一組和糞便污染有關(guān)的細(xì)菌。這一群細(xì)菌主要包括腸桿菌科的埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬（又叫產(chǎn)氣腸桿菌屬，包括陰溝腸桿菌和產(chǎn)期腸桿菌）、克雷伯氏菌屬的一部分和沙門菌屬的第Ⅲ亞屬（能發(fā)酵乳糖）的細(xì)菌。它們在生化及血清學(xué)方面并非完全一致，但都來自糞便，且與腸道病原菌的生活能力接近，故可作為食品、飲水等被糞便污染的間接指標(biāo)[2]。

大腸埃希氏菌是大腸菌群中的典型種，除大腸埃希氏菌外，大腸菌群的主要成員是產(chǎn)氣腸桿菌和若干檸檬酸桿菌等。食品中糞便含量只要達(dá)到10-3mg·kg-1即可檢出大腸菌群[3]。在具體鑒定時，一般規(guī)定產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的條件是37 ℃下48 h；美國標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定產(chǎn)氣的條件是35 ℃下48 h；英國的細(xì)菌學(xué)家進(jìn)一步規(guī)定氧化酶為陰性，在膽鹽或其他表面活性劑存在下能進(jìn)行好氧或厭氧性生長；而英國乳品微生物學(xué)家則除上述要求外，還規(guī)定乳糖發(fā)酵的溫度為30 ～35 ℃[4]。我國大腸菌群檢測GB 4789.3—2016 是參考ISO 4832—2006 和BAM：Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria（2002）的內(nèi)容修訂完成，分為MPN 法和平板計(jì)數(shù)法。

1 試驗(yàn)材料

1.1 樣品來源

樣品來自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心（CICC 質(zhì)控樣：FTQC-03-02 乳粉中的大腸菌群，F(xiàn)TQC-02-02 乳粉中的菌落總數(shù)）、中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院（CAIQ質(zhì)控樣：QC-FD-004 乳粉中的大腸菌群，QC-FD-002 乳粉中的菌落總數(shù)）以及新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督管理局（能力驗(yàn)證樣品：20-A030 乳粉中的菌落總數(shù)和大腸菌群，20-E690 乳粉中的菌落總數(shù)和大腸菌群）。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（PCA）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）和月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST），均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；氯化鈉，購自天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；3MPetrifilmTM 試紙片，購自美國3M 公司。

1.3 試驗(yàn)儀器

IGS400 恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司）、 LDZM-80KCS-2-01-00 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品處理方法

操作步驟：無菌開啟西林瓶，立即（1 min 內(nèi)）加入少量（2 ～4 mL）稀釋液（可以用生理鹽水或磷酸緩沖液）進(jìn)行再水化，稀釋液合計(jì)40 mL，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，反復(fù)用余下的稀釋液清洗西林瓶內(nèi)壁，回收清洗液放入上述的無菌瓶中，此溶液即是待測樣品原液（針對定量檢測項(xiàng)目，該40 mL 液體即為待測原液，即100），再按照無菌操作稀釋至10-6。全過程20 min 內(nèi)完成。將上述制備的40 mL 待測原液按照標(biāo)準(zhǔn)方法GB 4789.2—2016 和GB 4789.3—2016 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 2 種不同來源的質(zhì)控樣對比

將CICC 和CAIQ 的質(zhì)控樣品，按GB 4789.2—2016 標(biāo)準(zhǔn)方法檢測菌落總數(shù)，觀察不同培養(yǎng)時間對兩種質(zhì)控樣品菌落計(jì)數(shù)結(jié)果的影響。

2.3 2 種不同方法對能力驗(yàn)證樣品中菌落總數(shù)的測定比較

將新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督管理局的能力驗(yàn)證樣品，分別采用平板計(jì)數(shù)法和3M 試紙法測定菌落總數(shù)，每個樣品做6 個平行，取平均值，同時用質(zhì)控樣作為參照。

2.4 3 種不同方法對能力驗(yàn)證樣品中大腸菌群數(shù)的測定比較

將新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督管理局的能力驗(yàn)證樣品，參照GB 4789.3—2016，分別采用MPN 法、平板計(jì)數(shù)法和3M 試紙法進(jìn)行測定大腸菌群，每個樣品做雙平行試驗(yàn)，每組試驗(yàn)各設(shè)2 個空白對照，同時用質(zhì)控樣作為參照。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同培養(yǎng)時間對菌落總數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果的影響

樣品分別來自CICC 和CAIQ 質(zhì)控樣品，按 GB 4789.2-2016 標(biāo)準(zhǔn)方法檢測，觀察不同培養(yǎng)時間對兩種質(zhì)控樣品菌落計(jì)數(shù)結(jié)果的區(qū)別，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 不同培養(yǎng)時間對菌落總數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果的影響表 （單位：CFU·g-1）

如表1 結(jié)果所示，CICC 的樣品培養(yǎng)24 h 和培養(yǎng)48 h 計(jì)數(shù)結(jié)果差別不大，24 h 時有少量的菌落較小，計(jì)數(shù)時可能會有遺漏，造成結(jié)果偏小。CAIQ 的樣品培養(yǎng)24 h 計(jì)數(shù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值差別不大，培養(yǎng)48 h 后由于平板上有大量的片狀菌，直徑為1 ～2 cm，大量的片狀菌將24 h可以明顯觀察到的菌落形態(tài)較小的菌（直徑為0.5 ～1 mm）全部覆蓋，基本不能計(jì)數(shù)[5]。我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，除水產(chǎn)品外，菌落總數(shù)的計(jì)數(shù)時間為48 h，不同的樣品培養(yǎng)時間不能一概而論，培養(yǎng)24 h時應(yīng)對菌落先進(jìn)行一次預(yù)計(jì)數(shù)，培養(yǎng)48 h 時再對其進(jìn)行一次計(jì)數(shù)，若48 h 計(jì)數(shù)時沒有片狀菌落的計(jì)數(shù)干擾以48 h 計(jì)數(shù)結(jié)果為準(zhǔn)。若48 h 時菌落形態(tài)依然很小，肉眼難以計(jì)數(shù)，說明樣品中的菌落有可能屬于休眠或受損狀態(tài)，應(yīng)延長培養(yǎng)時間至72 h 再計(jì)數(shù)。

3.2 菌落總數(shù)兩種檢測方法的對比

如表2 所示，使用3M 試紙檢測結(jié)果值總體上要比使用平板計(jì)數(shù)法得到的值低，但結(jié)果值與質(zhì)控值接近，說明3M 試紙用于食品的快速檢測檢驗(yàn)結(jié)果比較可靠。

表2 菌落總數(shù)2 種檢測方法的對比表（單位：CFU·g-1）

3.3 大腸菌群3 種檢測方法的對比

樣品為來自新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督管理局的能力驗(yàn)證樣品，試驗(yàn)空白對照大腸菌群數(shù)均為零，檢測結(jié)果見表3。

表3 大腸菌群3 種檢測方法的對比表

如表3 所示，3 種檢測方法對比之后，MPN 法結(jié)果值與質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)值接近，說明MPN 法選擇性高，與平板計(jì)數(shù)法之間無明顯差異，相比較而言，3M 試紙片法方便快捷，可在檢測實(shí)驗(yàn)中作為對照或參考。

4 結(jié)論與討論

菌落總數(shù)在進(jìn)行能力驗(yàn)證時，應(yīng)充分考慮樣品中可能會添加的蔓延菌和生長遲緩細(xì)菌，因此在培養(yǎng)時間和觀察上應(yīng)該注意，必要的時候加入三苯基氯化四氮唑（TTC），或覆蓋一層培養(yǎng)基來有效抑制菌體蔓延[6]。培養(yǎng)基中若要加TTC，計(jì)數(shù)平板不得超過 300 CFU·g-1，否則平板上的菌落會呈色減弱或不呈色[7]。有時為了區(qū)分樣品和菌落可采用冷培養(yǎng)平板作為對照。另外，培養(yǎng)基傾注的溫度與厚度是實(shí)驗(yàn)正確與否的關(guān)鍵，溫度過高會造成已受損傷的菌細(xì)胞死亡，若培養(yǎng)基太薄，在培養(yǎng)過程中可能因水分蒸發(fā)而影響細(xì)菌的生長。應(yīng)注意每遞增稀釋一次，必須另換一支吸管，以保證樣品稀釋倍數(shù)的準(zhǔn)確性。

大腸菌群MPN 法初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，對于產(chǎn)酸未產(chǎn)氣的發(fā)酵管，可以用手輕輕拍打試管，如果有氣泡沿著管壁上升，應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生。這種情況在初發(fā)酵時，容易產(chǎn)生，此時可能會受到試管內(nèi)小倒管管口完整性、小倒管外是否有沉渣等影響，應(yīng)進(jìn)一步做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)[8]。大腸菌群中典型菌落主要包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌，建議檢驗(yàn)人員初次實(shí)驗(yàn)時取這4 種細(xì)菌進(jìn)行陽性對照試驗(yàn)，注意觀察并記錄典型大腸菌群形態(tài)，區(qū)分出典型菌落和可疑菌落。

此外，在菌落總數(shù)和大腸菌群計(jì)數(shù)時，還可能出現(xiàn)高稀釋倍數(shù)培養(yǎng)皿細(xì)菌數(shù)與低稀釋倍不成10 倍關(guān)系，或高稀釋倍數(shù)培養(yǎng)皿細(xì)菌數(shù)高于低稀釋倍數(shù)[9-10]，這可能是檢驗(yàn)過程操作有誤或者樣品中還含有防腐劑，此時的計(jì)數(shù)結(jié)果不應(yīng)作為檢測報告的依據(jù)。