何 昊，錢小英，靳曼菲，王凱迪，鄭 蕾，成 昭

西安醫(yī)學院藥學院，西安 710021

肺癌為臨床最常見的惡性腫瘤疾病之一，肺癌的發(fā)病率和死亡率在絕大多數國家和地區(qū)中男性均高于女性。在中國等發(fā)展中國家，由于煙草的使用持續(xù)增加等因素，肺癌的發(fā)病率也在逐步增加[1]。研究表明，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)在肺癌中比例超過80%，且5年生存率低于15%[2]，大細胞肺癌即為其中一種。中醫(yī)藥在治療肺癌方面具有較為悠久的傳統，并積累了較為寶貴的臨床應用經驗，中藥能夠通過提高免疫系統功能、降低血液黏度、影響腫瘤細胞周期以及誘導腫瘤細胞凋亡等方式來抑制肺癌細胞生長，防止肺癌發(fā)生轉移[3]。重樓為百合科植物云南重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand-Mazz.或七葉一枝花ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara的干燥根莖[4]。主產于四川、云南、陜西等地，七葉一枝花亦為秦巴山區(qū)特色太白七藥之一，為清熱解毒類中藥。現代藥理研究發(fā)現，重樓中發(fā)揮主要藥效作用的是其中的甾體皂苷類成分，即重樓皂苷。重樓皂苷VII即是其中之一，為具有偏諾皂苷元的皂苷類化合物，有研究顯示其有抗腫瘤活性[5,6]。本研究以人大細胞肺癌H460細胞為研究對象，觀察重樓皂苷VII作用后對細胞增殖、體外遷移、侵襲等的影響，為重樓皂苷應用于肺癌及相應的藥物開發(fā)提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

人大細胞肺癌NCI-H460細胞購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.1.2 藥品與試劑

重樓皂苷VII購自于成都普菲德生物技術有限公司(純度≥98%，批號：76296-75-8)；RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素、鏈霉素(美國HyClone公司)；四甲基偶氮唑藍噻唑藍(MTT)、Hoechst 33258染料(美國Sigma公司)；Matrigel基質膠(美國BD公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；MMP-2、MMP-9、caspase-3、ICAD、Bax、Bcl-2、GAPDH抗體(美國Proteintech公司)。

1.1.3 主要儀器設備

二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司，Thermo 3111)；倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司，IX73)；自動全波長酶標儀(美國Thermo Fisher公司，Multiskan GO)；分析電子天平(美國OHAUS公司，AX224ZH)；化學發(fā)光成像系統(美國Bio-Rad公司，ChemiDoc XRS+)；western blot系統(美國Bio-Rad公司，Universal)；超純水機(美國Thermo Fisher公司，MicroPure)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及重樓皂苷VII儲備液的配制

H460細胞于RPMI-1640完全培養(yǎng)液(10%血清和1%雙抗)中貼壁生長，培養(yǎng)箱條件為37 ℃，5%二氧化碳，取對數生長期的細胞用于實驗。重樓皂苷VII用DMSO溶解為100 mmol/L的濃度，分裝保存于-20 ℃冰箱，根據實驗需要用完全培養(yǎng)液稀釋成目標濃度，并保證DMSO的終濃度低于0.05%，使其不會對研究產生顯著影響。

1.2.2 重樓皂苷VII對細胞增殖能力的影響

取對數生長期H460細胞，0.25%胰蛋白酶消化，用RPMI-1640完全培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，稀釋至8×104個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h。吸出舊培養(yǎng)液，將重樓皂苷VII用完全培養(yǎng)液稀釋成不同濃度(0、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L)作用于細胞，每孔100 μL。24 h后，棄去原培養(yǎng)液，PBS洗滌兩次，每孔加入MTT溶液(MTT∶培養(yǎng)液=1∶9)100 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h后，棄去上清液，加入150 μL DMSO溶解甲臜，選擇490 nm波長，在酶標儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。按照細胞抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%，計算重樓皂苷對肺癌細胞H460抑制率及24 h的IC50。

1.2.3 細胞集落形成實驗

收集對數生長期的H460細胞，調整細胞濃度至3×103個/mL，6孔板中每孔加入2 mL細胞液，培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)液，加入2 mL不同濃度的重樓皂苷VII(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L)，連續(xù)培養(yǎng)20天。20天后除去培養(yǎng)液，每孔用500 μL甲醇固定15 min，PBS清洗2次，加入500 μL 0.1%結晶紫染色5 min，PBS清洗后拍照。

1.2.4 細胞劃痕實驗

將H460細胞懸液接種于6孔板內，待細胞貼壁生長后，在各孔細胞貼壁底部劃痕，并在實驗組各孔分別加入不同濃度的重樓皂苷VII(0.2、0.4、0.8 μmol/L)空白對照孔加入完全培養(yǎng)液。并于0、12、24、48 h在倒置顯微鏡下對劃痕拍照，觀察劃痕內細胞遷移情況。

1.2.5 細胞遷移和侵襲能力

Transwell遷移實驗：取對數生長期的H460細胞，消化重懸，調整濃度至2×105個/mL。Transwell小室中每孔接種200 μL細胞懸液，并在下室內每孔加入600 μL含20%血清的培養(yǎng)液，其中含有不同終濃度的重樓皂苷VII(0、0.1、0.2、0.4 μmol/L)，置于培養(yǎng)箱中。24 h后，棄去小室中培養(yǎng)液，PBS清洗后甲醇固定20 min，結晶紫染色3 min，棉簽擦去小室內細胞，顯微鏡下隨機5個視野觀察細胞。

Transwell侵襲實驗：將Matrigel膠用預冷的無血清培養(yǎng)液按1∶3稀釋后，均勻鋪于小室底部，于37 ℃培養(yǎng)箱中，孵育5 h，洗出小室內殘余液體，后續(xù)操作同Transwell遷移實驗。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達

取對數生長期的H460細胞，接種于T25培養(yǎng)瓶中，24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，使用含有0.4 μmol/L重樓皂苷VII的完全培養(yǎng)液，分別作用0、12、24、48 h后，收集細胞，裂解提取蛋白。用12%的SDS-PAGE電泳分離，之后轉移至PVDF膜，用5%的脫脂牛奶封閉2 h，洗滌后，使用不同濃度的一抗分別進行孵育，過夜。次日洗滌后，使用二抗繼續(xù)孵育1 h，洗滌后使用ECL發(fā)光液進行化學發(fā)光后，成像曝光條帶，以GAPDH為內參進行分析。

1.2.7 統計學分析

2 結果

2.1 重樓皂苷VII抑制H460細胞生長

不同濃度的重樓皂苷VII作用于H460細胞24 h后，與空白對照組對比，重樓皂苷VII處理組的細胞存活率顯著受到抑制，隨著濃度增加，細胞生長抑制作用也逐漸增強，其24 h的IC50值為0.98±0.24 μmol/L(圖1)。

圖1 重樓皂苷VII抑制H460細胞生長(n=3)Fig.1 Polyphyllin VII decreases the viability of H460 cells (n=3)

圖2 重樓皂苷VII處理H460細胞前后形態(tài)對比Fig.2 The morphology change of H460 cells after treatment of polyphyllin Ⅶ

圖3 重樓皂苷VII對H460細胞集落形成的影響Fig.3 The effect of polyphyllin VII on colony formation of H460 cells注：與對照組相比，**P<0.01。Note:Compared with control group,**P<0.01.

2.2 重樓皂苷VII對H460細胞形態(tài)和集落形成的影響

重樓皂苷VII(0.8 μmol/L)處理細胞24 h，與空白組相比，采用Hoechst 33258染色觀察發(fā)現，細胞存活率顯著下降，且細胞形態(tài)發(fā)生了變化(圖2)。此外，由圖3可見，隨著重樓皂苷VII濃度增大，H460細胞形成集落能力越弱，表明H460細胞集落的形成與重樓皂苷VII濃度呈負相關。

2.3 重樓皂苷VII對H460細胞遷移能力的影響

細胞劃痕實驗結果如圖4所示，不同濃度的重樓皂苷VII處理H460細胞以后，在0、12、24、48 h進行觀察，與空白對照組比較，處理組的細胞明顯跨越劃痕區(qū)域的速度變慢，劃痕愈合速度降低，說明重樓皂苷VII體外抑制H460細胞遷移具有濃度和時間依賴性。

2.4 重樓皂苷VII對H460細胞侵襲能力的影響

細胞Transwell小室遷移實驗結果顯示，用不同濃度的重樓皂苷VII處理細胞24 h后，從小室上層通過聚碳酸酯膜進入下室的細胞數量隨重樓皂苷VII濃度的增加而減少(圖5)。侵襲實驗結果同樣顯示，用不同濃度的重樓皂苷VII處理細胞24 h后，從小室上層透過基質膠進一步通過聚碳酸酯膜進入下室的細胞數量也隨重樓皂苷VII濃度增加而減少(圖6)。

2.5 重樓皂苷VII對H460細胞凋亡和遷移相關蛋白的影響

Western blot檢測結果顯示，隨著重樓皂苷VII作用時間的增加，基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)MMP-2和MMP-9表達顯著降低，提示其可能通過影響基質金屬蛋白酶從而干預細胞的遷移侵襲過程(圖7)。此外，凋亡相關蛋白剪切型caspase-3、Bax表達均升高，ICAD、Bcl-2表達含量降低，提示重樓皂苷VII可能誘導H460細胞發(fā)生了凋亡(圖8)。

圖6 重樓皂苷VII對H460細胞小室侵襲作用的影響Fig.6 Effect of polyphyllin VII on H460 cell invasion chamber assays

3 討論

據統計，約有50%以上的抗腫瘤藥物基于天然產物研究而來，多種天然來源的單體或提取成分都被證實具有抗腫瘤或誘導腫瘤細胞凋亡等作用[7,8]，因此，對于中藥和天然藥物開展研究，尋找具有抗腫瘤作用的單體或成分，具有十分重要的意義。重樓皂苷是提取自中藥重樓的有效成分，本課題組前期研究發(fā)現其具有較好的抗肺癌作用效果，能通過抑制PI3K-Akt和NF-κB通路誘導肺癌細胞凋亡[6]。本研究進一步表明，重樓皂苷VII具有抑制肺癌細胞生長的作用，并且能夠體外抑制其遷移和侵襲，還可能誘導凋亡的發(fā)生，同時，重樓皂苷VII調控細胞遷移和侵襲能力可能與其抑制基質金屬蛋白酶MMPs相關。MMPs是一類細胞外基質(extracellular matrix，ECM)降解酶，在多種惡性腫瘤中均過表達，其具有促進腫瘤細胞生長、遷移、侵襲，以及促進腫瘤血管新生等作用[9]。MMP-2和MMP-9是兩種主要的MMPs，同樣具有降解ECM，促進腫瘤遷移侵襲的作用[10]。本研究表明，重樓皂苷VII抑制肺癌細胞遷移和侵襲的作用與其調節(jié)MMP-2和MMP-9的表達相關，同時，重樓皂苷VII還能夠調節(jié)凋亡相關蛋白。CAD(caspase-activated deoxyribonuclease)是凋亡過程中使細胞核中DNA降解的一種酶，ICAD(inhibitor of CAD)則對其發(fā)揮抑制作用，在正常狀態(tài)下兩者均存在于胞漿中，維持細胞的正常生理活動[11]。重樓皂苷VII作用后，ICAD表達降低，從而使CAD抑制作用被減弱，發(fā)揮誘導凋亡的作用。Bcl-2家族是凋亡過程的重要參與者，其中Bax可促進凋亡的發(fā)生，Bcl-2則抑制凋亡的發(fā)生[12]。重樓皂苷VII作用后，Bcl-2表達降低，Bax表達升高，最終達到活化caspase家族蛋白并啟動凋亡程序的目的。Caspase-3是最終的凋亡執(zhí)行蛋白，其被活化剪切后，誘導了凋亡的發(fā)生[13]。綜上所述，重樓皂苷VII能夠顯著抑制肺癌H460細胞的增殖、遷移、侵襲，其機制與調節(jié)MMPs家族蛋白并最終誘導凋亡相關，本研究豐富了重樓皂苷抗腫瘤研究的相關基礎，為重樓皂苷的進一步研究開發(fā)提供了參考。

圖7 重樓皂苷VII對基質金屬蛋白酶的影響Fig.7 Effect of polyphyllin VII on MMPs

圖8 重樓皂苷VII對凋亡相關蛋白的影響Fig.8 Effect of polyphyllin VII on apoptosis-associated proteins